發(fā)布時間：2018-10-05 19:18

【摘要】：[目的]通過研究恒古骨傷愈合劑對于體外培養(yǎng)的人骨髓間充質干細胞的影響,來探尋恒古骨傷愈合劑治療骨質疏松及骨質疏松性骨折的骨形成機制。同時,研究恒古骨傷愈合劑直接作用于人骨髓間充質干細胞的最適濃度,以及體外恒古骨傷愈合劑誘導人骨髓間充質干細胞分化情況。為進一步研究恒古骨傷愈合劑促進骨質疏松及骨質疏松性骨折骨形成機制作鋪墊。[方法]立成熟的人骨髓間充質干細胞細胞系,穩(wěn)定傳代后給予恒古骨傷愈合劑誘導。1.首先篩選恒古骨傷愈合劑細胞層面誘導人骨髓間充質干細胞的最適稀釋劑量,觀察不同濃度恒古骨傷愈合劑作用于人骨髓間充質干細胞后,人骨髓間充質干細胞的生長、增殖情況。2.同時設置空白對照組(只加入培養(yǎng)基)、陽性對照組(1-34 PTH)、實驗組(加入最適濃度恒古骨傷愈合劑),培養(yǎng)6d'并繪制細胞生長、增殖曲線。3.根據誘導后骨髓間充質干細胞的生長、增殖情況,持續(xù)誘導3周、4周后,觀察人骨髓間充質干細胞分化情況。人骨髓間充質干細胞具有多重分化、潛在分化的能力,可向有利于骨質疏松及骨質疏松性骨折骨形成方向的細胞--成骨細胞、成軟骨細胞、成脂肪細胞分化。使用常規(guī)染色的方法(茜素紅染色成骨細胞、油紅O染色脂肪細胞、阿辛藍染色成軟骨細胞)、免疫細胞組織化學的方法對恒古骨傷愈合劑誘導人骨髓間充質干細胞的分化情況進行定性的研究。[結果]實驗結果顯示:1.正常濃度的恒古骨傷愈合劑稀釋16倍時,其刺激人骨髓間充質干細胞的的生長、增殖效果最為明顯,且具有統(tǒng)計學差異(P=0.032,0.05)。稀釋濃度過小的恒古骨傷愈合劑加入細胞培養(yǎng)過程,會抑制人骨髓間充質干細胞的生長、增殖,并導致人骨髓間充質干細胞的死亡;稀釋濃度大于16倍的恒古骨傷愈合劑作用于人骨髓間充質干細胞后,增殖效果較稀釋16倍的恒古骨傷愈合劑減弱,但總體表現(xiàn)仍為促進增殖。2.人骨髓間充質干細胞的生長、增殖曲線表明,培養(yǎng)24h后,已加入16倍稀釋恒古骨傷愈合劑孔和1-34甲狀旁腺激素孔的人骨髓間充質干細胞數量低于對照組人骨髓間充質干細胞數量;在培養(yǎng)24-48h期間,恒古組和PTH組細胞大量增殖,遠高于對照組未給藥hBMSC細胞的數量;培養(yǎng)3d后,恒古組細胞增殖速度下降,PTH組細胞數量無明顯增殖,恒古組細胞數量高于PTH組細胞數量。培養(yǎng)5天后,恒古組細胞數量開始被對照組細胞數量超過。3.光鏡下hBMSC正常形態(tài)細胞呈長梭形,分布較均勻,平行排列呈螺旋狀或旋渦狀,細胞核清晰,核漿透明度高。稀釋16倍恒古骨傷愈合劑連續(xù)誘導4周后,茜素紅染色未出現(xiàn)明顯嗜堿性成骨細胞,肉眼未見明顯礦化結節(jié);油紅0染色后視野內可見大量透光小圓粒(脂肪小泡),富含光面內質網,脂肪細胞大量增生;阿辛藍染色后,細胞骨架藍染,但未見明顯橢圓形、較小的軟骨細胞。熒光顯微鏡下觀察,陰性對照組只有細胞核藍染,細胞骨架未特異性顯示;稀釋16倍恒古骨傷愈合劑誘導hBMSC四周后免疫熒光染色,可見大量成骨細胞骨架被紅色熒光標記;單個成骨細胞呈梭型,細胞骨架清晰可見,胞質豐富,細胞核大而藍染;脂肪細胞特異性免疫熒光染色,大量細胞特異性著色,細胞骨架和細胞核清晰可見,偶爾可見透亮、圓形、較小的未著色區(qū)域(脂滴空泡);未發(fā)現(xiàn)特異性著色的成軟骨細胞。[結論]1.體外培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞穩(wěn)定傳代后,加入稀釋16倍的恒古骨傷愈合劑可以促進人骨髓間充質干細胞生長、增殖;2.恒古骨傷愈合劑誘導人骨髓間充質干細胞3周后,可以促進人骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化、成脂肪細胞分化;4周后分化情況更為明顯;但是人骨髓間充質干細胞未表現(xiàn)出向成軟骨細胞方向分化。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R683

【參考文獻】

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本文編號：2254566