發(fā)布時間：2018-04-04 06:00

  本文選題：動脈粥樣硬化　切入點：CCRL2　出處：《蘇州大學》2015年博士論文

【摘要】：動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,以下簡稱AS)是一種多因素誘導的慢性炎癥性血管疾病,伴隨著脂質(zhì)在血管壁下的沉積,形成成分復雜、不斷擴大的易損斑塊,一旦斑塊破裂,形成的動脈血栓會造成管腔狹窄或堵塞,影響重要組織器官的供血,導致急性冠脈綜合征、心肌梗死和腦梗死等惡性臨床事件。在招募促AS的炎癥細胞過程中,涉及一系列包括白細胞的滾動、粘附、浸潤以及向內(nèi)膜下滲透等過程,這些大都是由趨化因子及其受體所介導,因此趨化因子及其受體在AS研究中一直廣受關注,通過基因敲除小鼠和拮抗劑等研究趨化因子及其受體系統(tǒng)在AS中的作用,能夠深入研究其致AS作用機制,目前已有專門針對趨化因子受體作為靶點而開發(fā)的治療藥物上市,所以這一領域的研究必將對AS干預治療起到積極作用。研究表明非典型性趨化因子CCRL2(即C-C類趨化因子受體樣蛋白2,chemokine CC-motif receptor-like 2)的表達非常廣泛,包括小鼠內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等,并參與許多病理過程。其配體為chemerin,而chemerin還可與的受體CMKLR1結(jié)合。尤其是已有報道chemerin和CMKLR1表達在人冠狀動脈及小鼠主動脈AS斑塊中,然而CCRL2是否促進AS的發(fā)展還不清楚。目的我們利用ApoE敲除小鼠建立AS模型,通過CCRL2、ApoE雙基因敲除小鼠證明CCRL2敲除對于AS發(fā)生發(fā)展的影響,闡明CCRL2及其配體chemerin參與AS發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制。方法1.利用ApoE-/-小鼠喂食高脂飼料0、4、8、12周模擬AS發(fā)病過程,而后提取主動脈的mRNA和蛋白,通過Quantitative real time-PCR、Western blot、ELISA技術檢測AS發(fā)生過程中小鼠主動脈內(nèi)CCRL2及chemerin的表達變化,以及血清中chemerin含量變化。2.對照組CCRL2+/+ApoE-/-和實驗組CCRL2-/-ApoE-/-小鼠喂食高脂飼料4、16、24周模擬AS過程,利用蘇丹紅IV染色,對比兩組小鼠整體主動脈以及主動脈弓、主動脈下行支斑塊大小,再利用冰凍切片結(jié)合油紅o染色技術,比較兩組小鼠主動脈根部斑塊大小。在此過程中,監(jiān)測兩組小鼠12周后的體重及血清中血脂含量在喂食高脂飼料前后的變化。3.對照組ccrl2+/+apoe-/-和實驗組ccrl2-/-apoe-/-小鼠喂食高脂飼料12周模擬as過程,使用各類炎癥細胞特異性標志(marker)包括巨噬細胞(moma-2)、樹突狀細胞(cd11c)、t淋巴細胞(cd3)、平滑肌細胞(αsma)等,利用主動脈根部冰凍切片結(jié)合免疫熒光方法,檢測ccrl2敲除是否影響斑塊內(nèi)各類炎癥細胞浸潤。利用冰凍切片結(jié)合masson染色技術,檢測斑塊內(nèi)膠原含量變化,以觀察ccrl2對于斑塊穩(wěn)定性的影響。利用rt-qpcr方法檢測小鼠主動脈內(nèi)m1、m2型巨噬細胞釋放的細胞因子(m1型:mcp-1、il-1β、il-12,m2型:il-10、cd163、cd301)的含量變化,以間接判斷ccrl2對于斑塊內(nèi)m1、m2型巨噬細胞分化的影響。最后體外培養(yǎng)兩組小鼠腹腔巨噬細胞,通過ox-ldl誘導巨噬細胞分化為泡沫細胞,利用油紅o染色觀察ccrl2敲除是否影響巨噬細胞向泡沫細胞分化過程。4.喂食高脂飼料12周的apoe-/-小鼠,利用主動脈根部冰凍切片結(jié)合免疫熒光染色技術,檢測as斑塊內(nèi)是否有ccrl2、chemerin、cmklr1的表達,并且利用巨噬細胞、樹突狀細胞、t淋巴細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞特異性marker(分別為cd68、cd11c、cd3、cd31、αsma)檢測ccrl2是否與這些炎癥細胞和血管壁中的細胞存在共定位,以明確ccrl2參與as過程是通過哪類細胞發(fā)揮作用。5.選取wt小鼠主動脈弓和主動脈下行支的血管,利用rt-qpcr和enface染色技術比較ccrl2在這兩個部位表達是否有差異,隨后利用小鼠左頸動脈分支結(jié)扎模型(pcl模型)造成血管擾動流,取wt小鼠行pcl手術0、24小時后取左、右頸動脈分別利用rt-qpcr和enface染色技術,檢測ccrl2在血流紊亂條件下,在血管內(nèi)的表達變化,以及在血管內(nèi)皮細胞表面是否能夠上調(diào)表達ccrl2以促進血管炎癥發(fā)生。最后取對照組ccrl2+/+apoe-/-和實驗組ccrl2-/-apoe-/-小鼠,行pcl手術,并喂食高脂飼料2周后,檢測左頸動脈斑塊形成情況,以判斷ccrl2是否影響血流紊亂條件所誘導的斑塊形成。6.對照組ccrl2+/+apoe-/-和實驗組ccrl2-/-apoe-/-小鼠通過大腿內(nèi)側(cè)注射脂多糖lps,造成小鼠股動脈血管急性炎癥模型,再通過細胞膜熒光染料dioc6標記白細胞,通過體視顯微鏡觀察ccrl2敲除后對于炎癥狀態(tài)下白細胞在血管內(nèi)皮細胞表面滾動粘附的變化。隨后通過骨髓移植實驗,將cmklr1+/+apoe-/-與cmklr1-/-apoe-/-骨髓細胞(5×106個/只)打入經(jīng)過輻照的apoe-/-小鼠體內(nèi),以得到骨髓cmklr1存在或缺失的嵌合體小鼠,利用上述股動脈血管炎癥模型,觀察敲除造血系統(tǒng)中的cmklr1對于白細胞與血管內(nèi)皮細胞間的滾動粘附的影響。7.最后利用對照組ccrl2+/+apoe-/-和實驗組ccrl2-/-apoe-/-喂食高脂飼料12周模擬as過程,利用冰凍切片結(jié)合免疫熒光技術,研究ccrl2敲除后斑塊內(nèi)chemerin含量以及cmklr1+巨噬細胞含量是否變化,以明確斑塊內(nèi)ccrl2與chemerin的相互作用以及對斑塊內(nèi)cmklr1+巨噬細胞浸潤的影響。同時通過免疫熒光三色共染技術檢測兩組小鼠是否在斑塊表面和斑塊內(nèi)部形成的ccrl2/chemerin/cmklr1軸。通過elisa方法,檢測兩組小鼠血清中chemerin含量,以證實ccrl2對于as狀態(tài)下血清中chemerin含量的調(diào)控作用。結(jié)果1.針對apoe-/-小鼠,相比喂食高脂飼料之前,在喂食高脂飼料4、8、12周后,ccrl2的mrna表達隨著喂食高脂飼料而上調(diào),4周時達到最高點(提高2.85倍),并且在8周、12周維持較高表達的狀態(tài),chemerin的mrna表達也會上調(diào)表達,同樣在4周達到最高點(提高1.72倍),8周維持高表達,12周時恢復正常水平。而ccrl2蛋白表達在喂食高脂飼料后也有顯著提高,在8周時達到最高點(提高1.3倍)。檢測血清中chemerin的含量,apoe-/-小鼠喂食高脂飼料12周相比wt小鼠chemerin水平明顯上調(diào)。2.當喂食高脂飼料4、16、24周過后,相比對照組ccrl2+/+apoe-/-,實驗組ccrl2-/-apoe-/-小鼠的整體主動脈內(nèi)斑塊面積分別減小32.6%、27.2%、35.2%。針對主動脈弓和主動脈下行支的as斑塊形成進行統(tǒng)計,喂食高脂飼料4、16、24周后,主動脈弓斑塊面積分別減小38.8%、37.8%、28.6%,而喂食高脂飼料4、16周時實驗組小鼠主動脈下行支斑塊較對照組并無差別,到喂食24周時出現(xiàn)差別,減小40.8%。并且在16周高脂飼料后,檢測主動脈根部斑塊形成,實驗組ccrl2-/-apoe-/-小鼠較對照組減小47.9%。最后測定兩組小鼠喂食高脂飼料前后體重以及血清中血脂含量(包括總膽固醇tc、甘油三酯tg、高密度脂蛋白hdl-c、低密度脂蛋白膽固醇ldl-c)并無差異。3.喂高脂飼料12周后,相比對照組ccrl2+/+apoe-/-,實驗組ccrl2-/-apoe-/-小鼠的主動脈根部巨噬細胞浸潤減少58.4%,并且血管內(nèi)m1型巨噬細胞比例下調(diào),m2型巨噬細胞比例上調(diào),而其他炎癥細胞如t淋巴、樹突狀、平滑肌細胞含量以及膠原含量均無差異。最后體外培養(yǎng)兩組小鼠腹腔巨噬細胞,ox-ldl誘導形成泡沫細胞,統(tǒng)計泡沫細胞形成油紅o染色結(jié)果表明ccrl2敲除后影響巨噬細胞向泡沫細胞分化過程。4.喂食高脂飼料12周后,apoe-/-小鼠主動脈根部進行冰凍切片結(jié)合免疫熒光結(jié)果表明,ccrl2與as斑塊內(nèi)內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞以及t淋巴細胞均存在共定位,而與vsmc無共定位,推測ccrl2可能是通過內(nèi)皮細胞、巨噬細胞等促進as的發(fā)展。5.我們檢測到wt小鼠主動脈弓ccrl2的mrna水平比主動脈下行支表達量高,且結(jié)合enface染色技術觀察到主動脈弓血管內(nèi)皮表面有大量ccrl2表達,而主動脈下行支則幾乎無ccrl2表達。建立pcl的模型24小時后,暴露血流紊亂環(huán)境下的左頸動脈內(nèi)ccrl2的mrna相比在穩(wěn)流環(huán)境下的右頸動脈的表達有明顯上調(diào),進一步直接觀察左頸動脈血管內(nèi)皮表面結(jié)合enface染色結(jié)果表明ccrl2在血管內(nèi)皮層表達明顯比右頸動脈高。最后利用左頸動脈pcl模型加喂食高脂飼料2周所誘導的頸動脈as模型中,相比對照組ccrl2+/+apoe-/-,實驗組ccrl2-/-apoe-/-小鼠左頸動脈斑塊面積減少44.72%。6.在lps誘導的股動脈血管急性炎癥模型中,相比對照組ccrl2+/+apoe-/-,實驗組ccrl2-/-apoe-/-小鼠的白細胞在動脈內(nèi)的滾動減少44.8%,后續(xù)骨髓移植實驗將cmklr1+/+apoe-/-或cmklr1-/-apoe-/-的骨髓移植到輻照的apoe-/-小鼠體內(nèi)結(jié)果證實cmklr敲除后白細胞在血管急性炎癥模型中在股動脈中滾動受到抑制,白細胞滾動數(shù)量減少56%。說明造血系統(tǒng)中白細胞cmklr1的缺失影響血管內(nèi)皮ccrl2對cmklr1+細胞的招募。7.冰凍切片結(jié)合免疫熒光染色表明,與對照組ccrl2+/+apoe-/-相比,實驗組ccrl2-/-apoe-/-小鼠的主動脈根部在ccrl2敲除后斑塊內(nèi)chemerin含量減少,并且cmklr1+巨噬細胞含量減少78.5%。另外在ccrl2+/+apoe-/-小鼠as斑塊表面以及斑塊內(nèi)部均發(fā)現(xiàn)ccrl2與chemerin和cmklr1的共定位,而作為陰性對照的ccrl2-/-apoe-/-小鼠as斑塊內(nèi)則沒有發(fā)現(xiàn)這種共定位存在。推測他們?nèi)�者在as過程中參與白細胞浸潤和炎癥細胞相互作用方面起到重要作用。而ccrl2-/-apoe-/-小鼠相比ccrl2+/+apoe-/-小鼠,血清中chemerin含量上調(diào)29.8%。說明ccrl2在as狀態(tài)下,對于血清中chemerin水平具有調(diào)控作用。結(jié)論1.CCRL2敲除減小動脈粥樣硬化模型小鼠的斑塊形成。2.CCRL2敲除影響AS斑塊內(nèi)巨噬細胞的浸潤及分化。3.血管擾動流條件,誘導血管內(nèi)皮細胞上調(diào)表達CCRL2。敲除CCRL2減小頸動脈結(jié)扎AS模型中的斑塊形成。4.血管內(nèi)皮細胞表達的CCRL2可能參與調(diào)控局部chemerin的募集,影響CMKLR1+單核/巨噬細胞向內(nèi)皮下的浸潤5.CCRL2參與AS的發(fā)生發(fā)展是通過與其chemerin、CMKLR1相互作用來完成的。
[Abstract]:The expression of CCRL2 and its receptor in AS was studied by means of quantitative real time - PCR , Western blot and ELISA .

【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R543.5

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