發(fā)布時(shí)間：2020-10-29 16:55

　　 背景:生物工程和體外培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步導(dǎo)致了用于藥物療效/毒性測(cè)試[1]、疾病建模[2],以及心臟發(fā)育的力學(xué)研究[3-5]的心肌模型開發(fā)的迅速擴(kuò)大。然而,這類技術(shù)的廣泛應(yīng)用是建立可靠的人類心肌細(xì)胞來源的基礎(chǔ)上,這一技術(shù)被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建能夠準(zhǔn)確模擬活體組織的工程化的人類心臟結(jié)構(gòu)。為此,科學(xué)家近年來致力于開發(fā)新型工程仿生心臟組織平臺(tái),以準(zhǔn)確地再現(xiàn)人類心肌的結(jié)構(gòu)和功能。在心臟工程領(lǐng)域,誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)因?yàn)槠鋪碜杂谧陨眢w細(xì)胞,故能夠開發(fā)基于個(gè)體的醫(yī)療策略和特定患者的疾病模型,具備廣闊的應(yīng)用前景。迄今為止用于心臟建模的其他方法包括使用仙臺(tái)病毒載體[6-8],該方法消除了與將轉(zhuǎn)基因整合到宿主細(xì)胞基因組有關(guān)的翻譯問題。此外,利用等體質(zhì)粒[9-12]、microRNAs[13]和直接蛋白質(zhì)傳遞[14-18]都被證明能夠產(chǎn)生可分化為跳動(dòng)的心肌細(xì)胞的ipSCs。對(duì)于在推進(jìn)臨床和基礎(chǔ)科學(xué)研究中使用iPSC線的熱情,人們對(duì)這些細(xì)胞是否與ESCs相同表示了關(guān)注。一方面,有人認(rèn)為iPSCs和ESCs幾乎相同,因?yàn)檫@兩種細(xì)胞在體外表現(xiàn)出相似的表型、依賴性和行為[19-23]。此外,對(duì)大量克隆進(jìn)行的分析表明,iPSC和ESC源在細(xì)胞特性方面存在相當(dāng)大的重疊,因此,如果不進(jìn)行深入測(cè)試,很難區(qū)分它們[24-28]。另一方面,微陣列研究表明,數(shù)百個(gè)基因以及DNA甲基化模式在iPSCs和ESCs之間存在差異表達(dá)[28-32]。總體而言,對(duì)iPSC和ESC系一系列特性的測(cè)量,包括基因表達(dá)、DNA甲基化、微RNA表達(dá)、分化傾向和胚胎中的互補(bǔ)活性,表明它們的特性確實(shí)不同[32-38]。雖然iPSC和ESC細(xì)胞之間存在著特定的差異,但是很少有確鑿的證據(jù)表明,從這些細(xì)胞來源產(chǎn)生的心肌細(xì)胞一旦分化就會(huì)有任何有意義的區(qū)別。因此,盡管未分化干細(xì)胞來源有明顯不同,iPSCs和ESC衍生心肌細(xì)胞之間具有高度的可比性,而且通常采用的心臟分化方法的重復(fù)性,再加上iPSCs在疾病建模和個(gè)性化醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面的優(yōu)勢(shì),使得iPSCs在臨床和基礎(chǔ)心臟研究應(yīng)用中都具有廣闊的應(yīng)用前景。目的:建立適合于藥物心臟毒性評(píng)價(jià)的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞(hiPSC-CM)模型,并采用此模型評(píng)價(jià)化合物潛在的心臟毒性。方法:研究選用不同種類的心臟毒性藥物:蒽環(huán)類抗癌藥阿霉素(10 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1μmol·L-1 和 10 μ mol·L-1)、Ⅲ類抗心律失常藥物胺碘酮(10 nmol·L-1、100nmol.L-1、300 nmol·L-1、1μmol·L-1 和 10μmol·L-1)、鈣離子通道阻滯劑維拉帕米(10nmol·L-1、100nmol·L-1、1μmol·L-1 和 10μmol·L-1),分別與hiPSC-CM孵育,采用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)心肌細(xì)胞搏動(dòng)的頻率、振幅、細(xì)胞指數(shù)、場(chǎng)電位時(shí)程等指標(biāo)在給藥前后的變化,建立人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞體外心臟毒性評(píng)價(jià)模型。結(jié)果:1.心肌細(xì)胞的純度鑒定為了驗(yàn)證誘導(dǎo)多能干細(xì)胞源性心肌細(xì)胞實(shí)時(shí)細(xì)胞評(píng)價(jià)系統(tǒng)的精確性,采用流式細(xì)胞術(shù)的方法進(jìn)行檢測(cè)心肌細(xì)胞特征性蛋白肌鈣蛋白(cardiac troponin T,cTnT)從而證明心肌細(xì)胞純度達(dá)99%。形態(tài)學(xué)純度鑒定指出分化的心肌細(xì)胞中肌鈣蛋白含量較高。2.胺碘酮對(duì)hiPSC-CM相關(guān)指標(biāo)的影響為了驗(yàn)證胺碘酮對(duì)hiPSC-CM相關(guān)指標(biāo)的影響,我們檢測(cè)了 hiPSC-CM的收縮力、收縮頻率、增殖曲線和場(chǎng)電位時(shí)程(FPDc)。結(jié)果顯示:hiPSC-CM搏動(dòng)穩(wěn)定后,給予不動(dòng)濃度的胺碘酮(10 nmol·L-1、100 nmol·L-1、300 nmol·L-1、1μmol·L-1、10μmol·L-1)后,結(jié)果顯示,10nmol·L-1、100nmol·L-1、30 nmol·L-1三個(gè)濃度對(duì)心肌收縮力、收縮頻率、增殖曲線、場(chǎng)電位時(shí)程均不產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響;1μmol·L-1、10μmol·L-1的胺碘酮給藥后,顯示出對(duì)hiPSC-CM收縮力、收縮頻率的完全抑制;1μmol·L-1、10μmol·L-1的胺碘酮給藥后48h開始顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的細(xì)胞數(shù)量減低作用,顯示出細(xì)胞脫落增多,且10 μmol·L-1組細(xì)胞減少數(shù)量比1μmol·L-1組稍多,但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;10μmol·L-1的胺碘酮給藥后12h,顯示出對(duì)hiPSC-CM自主則的完全抑制;而1μmol·L-1濃度處理組大部分自主完全抑制,尚有少數(shù)仍有搏動(dòng)。3.維拉帕米對(duì)hiPSC-CM相關(guān)指標(biāo)的影響為了驗(yàn)證維拉帕米對(duì)hiPSC-CM相關(guān)指標(biāo)的影響,我們檢測(cè)了 hiPSC-CM的搏動(dòng)狀態(tài)、收縮力、收縮頻率、增殖曲線和場(chǎng)電位時(shí)程(FPDc)。結(jié)果顯示:hiPSC-CM搏動(dòng)穩(wěn)定后,給予不動(dòng)濃度的維拉帕米(10nmol·L-1、100nmol·L-1、1μmol·L-1、10 μmol·L-1)后,結(jié)果顯示,10nmol·L-1、100nmol·L-1兩個(gè)濃度對(duì)心肌收縮力、收縮頻率、增殖曲線、場(chǎng)電位時(shí)程均不產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響;隨著濃度的升高表現(xiàn)出對(duì)hiPSC-CM的抑制作用(P0.05)。4.阿霉素對(duì)hiPSC-CM相關(guān)指標(biāo)的影響為了驗(yàn)證阿霉素對(duì)hiPSC-CM相關(guān)指標(biāo)的影響,我們檢測(cè)了 hiPSC-CM的搏動(dòng)狀態(tài)、收縮力、收縮頻率、增殖曲線和場(chǎng)電位時(shí)程(FPDc)。結(jié)果顯示:hiPSC-CM搏動(dòng)穩(wěn)定后,給予不動(dòng)濃度的阿霉素(10 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1μmol·L-1、10μmol·L-1)后,結(jié)果顯示,10nmol·L-1、100nmol·L-1兩個(gè)濃度對(duì)心肌收縮力、收縮頻率、增殖曲線、場(chǎng)電位時(shí)程均不產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響;隨著濃度的升高表現(xiàn)出對(duì)hiPSC-CM的抑制作用(P0.05)。5.PM2.5對(duì)hiPSC-CM相關(guān)指標(biāo)的影響為了驗(yàn)證PM2.5對(duì)hiPSC-CM相關(guān)指標(biāo)的影響,我們檢測(cè)了 hiPSC-CM的收縮力、收縮頻率和增殖曲線。結(jié)果顯示:hiPSC-CM搏動(dòng)穩(wěn)定后,給予不動(dòng)濃度的PM2.5(10μg/ml、100μg/ml、100Oμg/ml)后,結(jié)果顯示,10μg/ml、100μg/ml兩個(gè)濃度對(duì)心肌收縮力、收縮頻率、增殖曲線均不產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響;隨著濃度的升高為1000 μg/ml時(shí)表現(xiàn)出對(duì)hiPSC-CM的抑制作用(P0.05)。結(jié)論:利用人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞可以建立一種可行的體外心臟毒性評(píng)價(jià)模型,結(jié)合實(shí)時(shí)細(xì)胞分析法可快速、靈敏、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)藥物的心臟毒性
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

圖１．胺碘酮對(duì)ｈｉＰＳＣ－ＣＭ收縮力（幅度）的影響??表１．胺碘酮對(duì)ｈｉＰＳＣ－ＣＭ收縮力（幅度）的影響＊Ｐ＜０．０５??￣￣?給藥前￣給藥后￣給藥后?給藥后￣給藥后￣給藥后￣給藥后￣給藥后￣給藥后￣給藥后￣給藥后?給藥后??７７?ｚＨ??１２ｈ?２４ｈ?３６ｈ?４８ｈ?６０ｈ?７２ｈ?７６ｈ?８０ｈ?８４?ｈ?９０ｈ?９６ｈ??０?ｌ°．ＤＭＳＯ?１００１０００?１０５±?００８?１．０４土０?０４?１０５土００６?１０５±００４?１．０７±０?０４?１．１１±０?０６?１．０６ｉ０?０６?１．１３±０１０?１０５±０．０８?１．１６±００８?１〇７±〇１〇??１０?ｎｍｏｌ?Ｌ－１?１．００＊０?００?０．９９±００５?０．９９±０１４?］?０６±０?０６?１０９±０１４?１．０５±０．１３?０．９２±０１０?０．８９＊０?０８?１．００±００６?１０１?±０．０８?０．９８±００８?０．８８±０．０７??ｌＯＯｉｉｍｏｌＬ－１?１００?士０．００?０．９９±?０?０５?１．２１±０１２?１２４＊０１４?１０９±０１３?ｌ．］７±〇１５?１．１０±０１１?１．１０＊０．０９?１．０２＊０．０７?０．９４?±０．０７?１．００±００５?０９８±００５??３００?ｎｍｏｌ?Ｌ－１?ｌ．ＯＯｉＯ?ＯＯ?１．０５±０１２?１．２５±０１７?１１３±０１８?１０２±０１３?０．９４±０?０９?０．９８＊０．１３?１．００±０１２?１．１１±０１１?１０７±０．２０?１．０９±０?０６?１．０３±０．〇７??１?晴ｊＬ．ｌ?１．００１０．００?０．１６±０．１６?０，４４?±０．２８?０．０７±０

予不同濃度的胺碘酮（１０?ｎｍｏｌ．Ｌ＿ｌ、１００?ｎｍｏｌ．Ｉ／１、３００?ｎｍ〇ｒＬ＿ｌ、ｌｐｍｏｒｉ／１、??１０?ｐｍｏｌ?Ｌ—１?；）后，收縮力隨時(shí)間變化的曲線圖見圖２和表２。結(jié)果顯示，與對(duì)收??１９??

予不同濃度的胺碘酮（１０?ｎｍｏｌ．Ｌ－１、１００?ｎｍｏｌ．Ｉ／１、３００?ｎｍｏｌ．Ｌ＇?ｌ｜ｉｍｏｌ．Ｌ＿１、１０??ｐｍｏｌ．Ｌ－１）后，增殖曲線隨時(shí)間變化的曲線圖見圖３和表３，?ｌｐｍｏｌ．Ｌ＇ｌＯ＾ｍｏｌ．Ｉ；１??的胺碘酮給藥后４８ｈ開始顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的細(xì)胞數(shù)量減低作用，顯示出細(xì)胞??脫落增多，且ｌＯｐｍｏｌ?Ｌ／１組細(xì)胞減少數(shù)量比ｌｐｍｏｌ?Ｌ／１組稍多，但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差??異。１０?ｎｍｏｌ?Ｌ—１、１００?ｎｍｏｌ?Ｌ＇１、３００?ｎｍｏｌ?Ｕ１組別對(duì)增殖曲線不產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)意義??的影響。??２．０?ｎ??０．１％ＤＭＳＯ??１０?ｎｍｏｌ－?Ｌ－１??１?５－?ｌＯＯｎｍｏｌ－?Ｌ－１??３００ｎｍｏｌ－?Ｌ－１??ｃＳ?１｜ｊｍｏｌ－?Ｌ－１??Ｊ?１。＿?Ｍ??０．５－??０?１２?２４?３６?４８?６０?７２?８４?９６??ｔｉｍｅ（ｈ）??圖３．胺碘酮對(duì)ｈｉＰＳＣ－ＣＭ增殖曲線的影響??表３胺碘酮對(duì)ｈｉＰＳＣ－ＣＭ增殖曲線的影響＊Ｐ＜０．〇５??２１??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2861189