發(fā)布時間：2020-11-02 01:06

　　 細胞凋亡是一個高度保守的對正常發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)至關重要的過程。成人體內每天大約有五千萬到七千萬細胞經(jīng)歷細胞凋亡,無限制的細胞凋亡具有嚴重的病理后果,因此體內細胞凋亡受到嚴格管控。癌癥是一種細胞因損傷或惡變而獲得無限增殖能力的疾病,而逃避細胞凋亡是癌細胞的重要特征之一。在過去三十年中,研究已闡明癌細胞中細胞凋亡抑制的機制,這為研究靶向細胞凋亡的療法奠定了基礎。目前研究較成熟的細胞凋亡通路有兩條:死亡受體介導的外源性凋亡通路和線粒體介導的內源性凋亡通路。其中,Bcl-2家族蛋白作為關鍵地細胞凋亡調節(jié)因子之一,在線粒體凋亡通路中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細胞通過過表達抗凋亡Bcl-2蛋白或低表達促凋亡Bcl-2蛋白來逃避細胞凋亡,因此,通過靶向抗凋亡Bcl-2蛋白(如抗凋亡Bcl-2蛋白抑制劑)或重新激活促凋亡Bcl-2蛋白(如組蛋白去乙�；�酶抑制劑)可誘導細胞凋亡,進而殺死腫瘤細胞。新型抗凋亡Bcl-2蛋白抑制劑研究目前已報道的抗凋亡Bcl-2蛋白抑制劑大多為BH3模擬物,即通過模擬BH3-only蛋白的BH3結構域與抗凋亡Bcl-2蛋白的疏水性結合腔間特異性結合,干擾抗凋亡和促凋亡Bcl-2蛋白之間的蛋白-蛋白相互作用。酪氨酸衍生物41是本課題組過去研究制備的一個化學合成中間體,近期發(fā)現(xiàn)該化合物對Bcl-2蛋白具有一定的親和力(Ki=8.4 μM),適合作為先導化合物進行深入結構改造。分子對接結果顯示,41占據(jù)Bcl-2蛋白BH3疏水結合腔的p3和p4 口袋,而結構中苯磺酰胺部分的苯環(huán)朝向p2 口袋,但并未與之結合。結合分子對接結果以及文獻報道的Bcl-2蛋白抑制劑的構效關系,我們保留了先導化合物41的酪氨酸骨架和苯磺酰胺部分,在苯磺酰胺部分的苯環(huán)上引入取代基(硝基和R2),以期增加化合物與p2 口袋的結合,提高化合物與Bcl-2蛋白的親和力。其次,我們根據(jù)藥物化學的生物電子等排原理和同系原理將先導化合物41結構中的聯(lián)苯基團替換為取代苯基(R1)、Boc替換為各種�；�(R3),考察這兩部分對化合物與Bcl-2蛋白的親和力的影響。通過上述對先導化合物41的結構改造我們設計合成了一系列酪氨酸衍生物(series A)。此外,我們應用構象限制性原理,將酪氨酸骨架進行芳香氨基酸側鏈環(huán)化,以實現(xiàn)對先導化合物的骨架躍遷,設計合成了一系列四氫異喹啉類衍生物(series B)。與series A設計思路類似,我們在苯磺酰胺部分的苯環(huán)上引入取代基(硝基、R3),以期增加化合物與p2 口袋的結合,增強化合物與Bcl-2蛋白的親和力;根據(jù)藥物化學生物電子等排原理和同系原理將先導化合物41結構中的聯(lián)苯基團替換為烷基和取代苯基(R1)、Boc替換為各種烷基(R2),考察這兩部分對化合物與Bcl-2蛋白的親和力的影響。對合成的seriesA和seriesB系列目標化合物,我們首先采用熒光偏振法測定其對Bcl-2蛋白的親和力,然后選取代表化合物測定其對Bcl-XL和Mcl-1蛋白的親和力,探討目標化合物對Bcl-2家族蛋白的選擇性;同時采用MTT法測定代表化合物抗細胞增殖能力;根據(jù)上述實驗結果,選取化合物測定其誘導細胞凋亡及caspase-3活化的能力。測試結果顯示,部分目標化合物對Bcl-2蛋白的親和力明顯提升,14個series A化合物和14個series B化合物的活性優(yōu)于先導化合物41,其中A3、A24、A28、B25和B26等目標化合物的活性優(yōu)于陽性對照棉酚。對series A化合物而言,Boc基團對目標化合物與Bcl-2蛋白的親和力有很大影響。去除Boc基團后,相應目標化合物與Bcl-2蛋白的親和力喪失,如A14-A19;而當Boc被類似的酰基替換后,相應目標化合物與Bcl-2蛋白的親和力保持或提高,如A20-A28�？傮w而言,苯磺酰胺苯環(huán)上取代基取代有利于相應目標化合物與Bcl-2蛋白的親和力,如A3、A24和A28等;但是對位環(huán)烷基氨基類取代基除外,該類取代基將導致相應目標化合物與Bcl-2蛋白的親和力喪失,如A8、A9和A27。相對而言,聯(lián)苯部分的變化對相應目標化合物與Bcl-2蛋白的親和力影響不大,如A1 vs A3 vs A5、A6 vs A7 和 A24 vs A28。對series B化合物而言,當X為氫原子(B1-B5)或者R3為各種胺基(B10-B12,B18,B27-B29)時,相應目標化合物對Bcl-2蛋白親和力基本喪失;R1為取代芐基的目標化合物(如B9、B19和B25)對Bcl-2蛋白的親和力優(yōu)于R1為丙基的目標化合物(B6和B7);R2的變化對相應化合物對Bcl-2蛋白的親和力影響不大,但是4-苯基芐基除外,該取代基將導致相應化合物對Bcl-2蛋白親和力基本喪失(如B13 和 B20)。研究發(fā)現(xiàn),代表化合物A1、A24、A28、B19、B21、B25和B26對Mcl-1蛋白也具有良好的親和力,其中A28、B25和B26對Mcl-1蛋白的親和力優(yōu)于陽性對照棉酚;上述化合物與Bcl-XL蛋白親和力較差。代表化合物A1、A24、A28、B25和B26對腫瘤細胞均表現(xiàn)出一定的抗細胞增殖活性,而對正常細胞的抗增殖活性較差,表現(xiàn)出一定的腫瘤細胞選擇性;其中,A28的抗細胞增殖活性與陽性對照棉酚相當。進一步的研究表明,代表化合物A28和B25可劑量依賴性誘導Jurkat細胞細胞凋亡;10 μM和20 μ濃度的A28誘導Jurkat細胞48 h分別可導致6.2%和22.2%的細胞凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡),而DMSO對照組的凋亡率只有2.6%;15 μM和30 μM濃度的B25誘導Jurkat細胞48 h分別可導致7.3%和21.3%的細胞凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡),而DMSO對照組的凋亡率只有3.2%。此外,A28和B25還可劑量依賴性誘導Jurkat細胞中caspase-3的活化。新型組蛋白去乙�；�酶抑制劑研究前期我們在原有結構類型基礎上,設計合成了一系列2,6-二取代嘌呤類組蛋白去乙�；�酶抑制劑,初步活性研究發(fā)現(xiàn),部分化合物具有與陽性對照SAHA相當甚至更好的體外組蛋白去乙�；�酶抑制活性,遺憾的是這些化合物的體外抗腫瘤增殖活性一般;活性最優(yōu)化合物H5r對HeLa細胞提取物(主要含HDAC1和HDAC2)的IC50值為0.075 μM。我們以化合物H5r為先導化合物,運用生物電子等排原理將酶表面識別區(qū)的2,6-二取代嘌呤母核以2,9-二取代嘌呤替換,在嘌呤2位引入氯、氨基、取代胺基、嗎啉和磺酰胺基,9位引入各種烷基,考察相應2,9-二取代嘌呤作為酶表面識別區(qū)對化合物活性的影響;同時運用同系原理改變連接臂的長度,將連接基團的-CH2CONH-簡化為-NH-,考察連接臂的長度對化合物活性的影響。通過上述結構改造我們設計合成了一系列新型組蛋白去乙酰化酶抑制劑(series C)。對合成的series C化合物,我們首先測試了其體外抑酶活性,并且選取活性較好的化合物進一步測定了其對HDAC2和HDAC8亞型的抑制活性;其次,采用MTT法測定代表化合物抗腫瘤細胞增殖的能力;根據(jù)上述實驗結果,選取代表化合物進行western blot實驗檢測其對組蛋白H3乙�；�水平的影響;此外,我們還測定了代表化合物誘導細胞凋亡及caspase-3活化的能力。測試結果表明,9個目標化合物表現(xiàn)出與陽性對照SAHA相似或更優(yōu)的抑酶活性,其中目標化合物C9、C13和C14活性最佳,IC50值分別為30 nM、26 nM和27nM。連接臂的長度和嘌呤環(huán)的取代基對相應化合物的抑酶活性均有影響。連接臂較短的化合物(C1-C5和C21)抑酶活性較差,而連接臂為5或6個亞甲基時,相應化合物的抑酶活性較好(C6-C20、C22-C25);當嘌呤環(huán)2位為氨基或氯時,相應化合物的抑酶活性要優(yōu)于其它化合物,例如C13 vs C19和C12 vs C24,而且嘌呤環(huán)2位取代基越大時,相應化合物的抑酶活性越差;當嘌呤環(huán)9位有取代時,相應化合物的抑酶活性要優(yōu)于此處無取代的化合物,例如C7 vs C6和C9 vs C8。此外,代表化合物C9、C13和C14對HDAC2的抑制活性優(yōu)于HDAC8。代表化合物C9、C13和C14對腫瘤細胞均表現(xiàn)出一定的抗細胞增殖活性,其中化合物C13對所測三株腫瘤細胞的抗細胞增殖活性均優(yōu)于陽性對照SAHA。此外,western blot實驗表明目標化合物C13可劑量依賴性升高KG1細胞中組蛋白H3乙�；�水平,驗證了該化合物的HDAC靶向性。此外,研究表明C13可劑量依賴性誘導KG1細胞細胞凋亡:1μM和2 μM濃度的C13誘導KG1細胞24 h分別可導致20.7%和50.2%的細胞凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡),而DMSO對照組的凋亡率為14.2%;C13還可劑量依賴性誘導KG1細胞中caspase-3的活化。綜上所述,研究新型的藥物啟動腫瘤細胞凋亡是近年抗癌藥物領域的新興研究方向。圍繞腫瘤細胞的抗凋亡機制,我們設計合成了兩個系列抗凋亡Bcl-2蛋白抑制劑(series A和B)和一個系列組蛋白去乙�；�酶抑制劑(series C),期間共合成個了 147新化合物,其中新中間體65個,新結構目標化合物82個。相應目標化合物已經(jīng)1HNMR、13CNMR和HRMS結構確證,并進行了熔點和純度的測定。相關的生物活性研究表明,部分化合物能夠有效的通過誘導細胞凋亡殺死腫瘤細胞,這為課題組今后開發(fā)更高效的促進腫瘤細胞凋亡的新型抗癌藥物奠定了基礎。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R979.1
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
縮略語說明
第一章 前言
    1.1 細胞凋亡
    1.2 Bcl-2家族蛋白
    1.3 Bcl-2家族蛋白與癌癥
    1.4 本論文研究的誘導腫瘤細胞凋亡的策略
    1.5 總結
第二章 抗凋亡Bcl-2蛋白抑制劑的設計、合成及活性研究
    第一節(jié) 抗凋亡Bcl-2蛋白抑制劑研究進展
        1.1 小分子抑制劑
        1.2 合成的BH3 α-螺旋模擬物
        1.3 多肽抑制劑
    第二節(jié) 目標化合物的設計及合成
        2.1 目標化合物的設計
        2.2 Series A化合物的合成
        2.3 Series B化合物的合成
    第三節(jié) 目標化合物的生物活性研究
        3.1 熒光偏振實驗
        3.2 抗細胞增殖實驗
        3.3 細胞凋亡檢測
        3.4 Caspase-3檢測
        3.5 結果及討論
第三章 組蛋白去乙�；�酶抑制劑的設計、合成及活性研究
    第一節(jié) 組蛋白去乙�；�酶
    第二節(jié) 目標化合物的設計及合成
        2.1 目標化合物的設計
        2.2 標化合物的合成
    第三節(jié) 目標化合物的生物活性研究
        3.1 體外抑酶實驗
        3.2 HDAC2和HDAC8抑制實驗
        3.3 抗細胞增殖實驗
        3.4 Western blot實驗
        3.5 細胞凋亡檢測
        3.6 Caspase-3檢測
        3.7 結果及討論
第四章 總結及展望
    4.1 總結
    4.2 展望
參考文獻
致謝
攻讀學位期間發(fā)表的學術論文
附錄
學位論文評閱及答辯情況表


本文編號：2866360