發(fā)布時間：2020-11-05 00:17

　　 第一部分:GSK-LSD1聯(lián)合PTX對細胞MGC803/PTX的抑制作用目的:通過計算聯(lián)合作用指數(shù)(combined index,CI)判斷聯(lián)用藥物的抗腫瘤效果,比較聯(lián)合用藥與單一用藥抑制細胞生存的能力。方法:MTT法檢測藥物單用于細胞的抑制率。選擇抑制率5%~30%之間的濃度進行聯(lián)用濃度初篩,確定聯(lián)用時間;選擇最佳PTX濃度后再確定GSK-LSD1濃度,計算CI值。結(jié)果:成功確定GSK-LSD1與PTX聯(lián)用最佳時間為72h,最佳濃度分別為100uM及10nM,CI值為0.334,抑制率可達68.09%。第二部分:GSK-LSD1聯(lián)合PTX聯(lián)用組抗腫瘤作用及機制研究目的:研究聯(lián)用組對細胞MGC803/PTX的抗腫瘤作用及相關機制。1、聯(lián)用誘導細胞MGC803/PTX凋亡方法:熒光顯微鏡下觀察細胞及細胞核的形態(tài)變化;平板克隆法檢測細胞克隆形成能力。Annexin V/PI染色檢測細胞凋亡率;Western blot檢測Total-PI3K、P-PI3K、Total-AKT、P-AKT(Ser473)、Bax、BCl-2、Total-caspase3、Cleaved-caspase3、Total-PARP、Cleaved-PARP等蛋白表達量的變化。結(jié)果:聯(lián)用組具有明顯破碎細胞形態(tài)及細胞核的能力;聯(lián)用組較單用組克隆形成率低,細胞凋亡率更高。以上結(jié)果表明聯(lián)用組誘導細胞凋亡,其機制為下調(diào)P-PI3K、P-AKT(Ser473)、BCl-2的表達;同時上調(diào)Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-PARP的表達。2、聯(lián)用抑制細胞MGC803/PTX轉(zhuǎn)移方法:細胞劃痕實驗及Transwell實驗檢測細胞轉(zhuǎn)移能力。Western blot檢測ZO-1、Vimentin等蛋白的表達。結(jié)果:Transwell實驗和劃痕實驗結(jié)果表明,聯(lián)用組較單用組更能抑制MGC803/PTX細胞的轉(zhuǎn)移能力,其具體機制為上調(diào)ZO-1的表達、下調(diào)Vimentin的表達。3、聯(lián)用促進細胞MGC803/PTX發(fā)生自噬方法:DCFH-DA染色檢測胞內(nèi)活性氧含量;免疫熒光實驗和透射電鏡觀察自噬體的產(chǎn)生。Western blot檢測LC3B、P62等蛋白的表達;聯(lián)用組加入自噬抑制劑3-MA檢測LC3B、P62等蛋白含量的表達的逆轉(zhuǎn)變化。結(jié)果:DCFH-DA染色檢測到聯(lián)用組顯著增加胞內(nèi)活性氧含量;免疫熒光實驗及透射電鏡觀察到聯(lián)用組產(chǎn)生更多自噬體。聯(lián)用組促進細胞MGC803/PTX發(fā)生自噬,具體機制為上調(diào)LCII/LCI的比例、下調(diào)P62的表達;聯(lián)用組加入3-MA后下調(diào)LCII/LCI的比例、上調(diào)P62的表達。結(jié)論:1.LSD1與微管蛋白是抗腫瘤藥物的兩個靶點,將兩種靶點藥物相結(jié)合作用于耐藥細胞是一種新的藥物聯(lián)用方式。本課題確定了GSK-LSD1與PTX聯(lián)用的最佳時間為72h,最佳濃度分別為100μM及10nM,抑制率可達68.09%,CI值為0.334,根據(jù)Soriano等判斷方法0.2≤CI≤0.4為強協(xié)同作用;2.聯(lián)用組作用于MGC803/PTX后細胞及細胞核形態(tài)、克隆形成率、凋亡率等均發(fā)生明顯變化;聯(lián)用組下調(diào)P-PI3K、P-AKT(Ser473)、BCl-2的表達;上調(diào)Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-PARP的表達,說明聯(lián)用組通過PI3K/AKT介導的凋亡通路誘導凋亡;3.聯(lián)用組較單用組明顯抑制了細胞MGC803/PTX轉(zhuǎn)移,同時上調(diào)ZO-1的表達、下調(diào)Vimentin的表達,說明聯(lián)用組可通過抑制轉(zhuǎn)移而抑制細胞增殖;4.與單用組相比,聯(lián)用組顯著增加胞內(nèi)活性氧及自噬體含量,且上調(diào)LCII/LCI的比例、下調(diào)P62的表達,說明聯(lián)用組促進細胞發(fā)生自噬。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R95
【部分圖文】：

藥物作用于MGC803/PTX細胞后細胞及細胞核的形態(tài)學變化

圖 2.2 各組細胞的克隆形成能力及克隆形成率A.細胞克隆形成能力；B.克隆形成率表 2.1 四組克隆形成率統(tǒng)計Group Colony forming efficiency (%)

藥物作用于MGC803/PTX細胞的凋亡檢測A.細胞凋亡分布圖；B.細胞凋亡率統(tǒng)計圖
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本文編號：2870822