本文關(guān)鍵詞：利用Tol2轉(zhuǎn)座子構(gòu)建斑馬魚(yú)心臟組織特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體及其表達(dá)分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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生物工程學(xué)報(bào)
journals.im.ac.cn cjb@im.ac.cn

Chin J Biotech 2010, February 25; 26(2): 230?236 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 ?2010 CJB, All rights reserved.
生物技術(shù)與方法

利用 Tol2 轉(zhuǎn)座子構(gòu)建斑馬魚(yú)心臟組織特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因 載體及其表達(dá)分析
陳婷芳，羅娜，謝華平，吳秀山，鄧云
湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 心臟發(fā)育研究中心，長(zhǎng)沙 410081

摘

要: 為了制備用于在斑馬魚(yú)心臟中特異表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因載體，通過(guò)分子克隆的方法對(duì)能夠在斑馬魚(yú)心臟中

特異表達(dá) EGFP 報(bào)告基因的 Tol2 載體進(jìn)行了改造，在原有的 CMLC2 啟動(dòng)子與 EGFP 編碼區(qū)之間插入帶有多克隆位點(diǎn) 的 IRES 序列，獲得 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，該載體可以實(shí)現(xiàn)在同一個(gè)啟動(dòng)子 CMLC2 的驅(qū)動(dòng)下分 別同時(shí)表達(dá)目的基因和 EGFP；為了驗(yàn) 證該表達(dá)載體 的有效性，進(jìn) 一步在 CMLC2 啟動(dòng)子與 IRES 序列之 間插入 DsRed-Monome 編碼區(qū)， 利用得到的 pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP 轉(zhuǎn)基因載體顯微注射到斑馬魚(yú)單細(xì)胞期胚胎中進(jìn)行 表達(dá)分析，結(jié)果表明外源目的基因 DsRed-Monome 和報(bào)告基因 EGFP 均能以相同的表達(dá)模式在斑馬魚(yú)心臟組織中特異 表達(dá)。pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的成功構(gòu)建對(duì)于建立心臟發(fā)育候選基因的斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)?zāi)Ｐ途哂?重要意義。 關(guān) 鍵 詞 : Tol2 轉(zhuǎn) 座 子 ， 斑 馬 魚(yú) ， 轉(zhuǎn) 基 因 ， 心 臟 特 異 表 達(dá)

Construction and expression analysis of the zebrafish heart-specific transgenetic vector based on Tol2 transposable element
Tingfang Chen, Na Luo, Huaping Xie, Xiushan Wu, and Yun Deng
College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha 410081, China

Abstract: In an effort to generate a desired expression construct for making heart-specific expression transgenic zebrafish, a Tol2
plasmid, which can drive EGFP reporter gene specifically expressed in the heart, was modified using subcloning technology. An IRES fragment bearing multiple cloning site (MCS) was amplified directly from pIRES2-EGFP plasmid and was inserted between the CMLC2 promoter and EGFP fragment of the pDestTol2CG vector. This recombinant expression plasmid pTol2-CMLC2-IRES-EGFP can drive any interested gene specifically expressed in the zebrafish heart along with EGFP reporter gene. To test the effectiveness of this new expression plasmid, we constructed pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP plasmid by inserting another reporter gene DsRed-Monome into MCS downstream of the CMLC2 promoter and injected this transgenic recombinant plasmid into one-cell stage embryos of zebrafish. Under fluorescence microscope, both the red fluorescence and the green

Received: August 14, 2009; Accepted: December 16, 2009 Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30671137), Postgraduate Scientific Innovation Fund of Hunan Province (No. CX2009B108). Corresponding author: Yun Deng. Tel: +86-731-88872780; Fax: +86-731-88615078; E-mail: dengyun2008@yahoo.com.cn 國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 30671137)，湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目 (No. CX2009B108) 資助。

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fluorescence produced by pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP were detected specifically in the heart tissue in the same expression pattern. This novel expression construct pTol2-CMLC2-IRES-EGFP will become an important tool for our research on identifying heart development candidate genes’ function using zebrafish as a model. Keywords: Tol2 transposon, zebrafish, transgenesis, heart-specific expression

轉(zhuǎn)座子作為插入突變?cè)春头肿訕?biāo)簽被廣泛應(yīng)用 于基因的分離、克隆以及基因功能分析，利用基因 的轉(zhuǎn)座原理可研究基因的調(diào)控模式，可為脊椎動(dòng)物 細(xì)胞的分化和發(fā)育提供依據(jù) [1]。Tol2 是近年發(fā)現(xiàn)的 唯一的天然存在且具有轉(zhuǎn)座活性的脊椎動(dòng)物轉(zhuǎn)座 子，存在于中國(guó)、韓國(guó)、日本等國(guó)的一種淡水魚(yú)—— 青鳉 Oryzias latipes 的基因組中 。Kawakami 等利 用 Tol2 轉(zhuǎn)座子構(gòu)建了含有特異性啟動(dòng)子調(diào)節(jié)基因表 達(dá)的序列 (SIX3.2:gfp) 載體，該質(zhì)粒 DNA 和體外 合成的相應(yīng)轉(zhuǎn)座酶基因 mRNA 共注射到單細(xì)胞期 斑馬魚(yú)胚胎中。插入基因組的轉(zhuǎn)座子序列能高頻率 傳遞 F1 斑馬魚(yú)，其中特異性啟動(dòng)子調(diào)節(jié)基因表達(dá) 的序列 (SIX3.2:gfp) 可以穩(wěn)定存在于轉(zhuǎn)基因魚(yú) 。 Tol2 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在脊椎動(dòng)物的基因克隆和基因功能 分析方面具有重要的應(yīng)用前景，對(duì)分子生物學(xué)的發(fā) 展有著深遠(yuǎn)的意義。但是，目前還沒(méi)有適合斑馬魚(yú) 心臟組織特異性表達(dá)外源目的基因的 Tol2 轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn) 基因載體。 Kwan 等將 Tol2 轉(zhuǎn)座子中轉(zhuǎn)座酶編碼基因切除， 代之以 CMLC2-EGFP-polyA 表達(dá)序列和其他重組 篩選序列， CCDB (Control of cell death) 基因序列 如 等，構(gòu)建了 pDestTol2CG2 質(zhì)粒，將該質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座酶 mRNA 一起顯微注射斑馬魚(yú)單細(xì)胞期胚胎，觀察到 斑馬魚(yú)心臟組織中有綠色熒光蛋白特異表達(dá)，同時(shí) 外源片段整合效率高 。但是直接將 pDestTol2CG2 質(zhì)粒用于心臟發(fā)育候選基因的斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因載體還 有許多缺陷。首先，CMLC2 啟動(dòng)子下游沒(méi)有可供選 擇的多克隆位點(diǎn)以便插入一個(gè)心臟發(fā)育候選基因編 碼序列；其次，如果將 EGFP 編碼基因切除，代之 以其他心臟發(fā)育候選基因編碼序列，失去報(bào)告基因 ——綠色熒光蛋白的表達(dá)對(duì)分析目的基因的表達(dá)非 常不方便；第三，如果將心臟發(fā)育候選基因編碼序 列與 EGFP 編碼基因直接連接， CMLC2 啟動(dòng)子驅(qū) 在 動(dòng)下兩個(gè)蛋白融合表達(dá)，目的基因蛋白的生物活性
[4] [3] [2]

可能受到影響。 為了構(gòu)建適用于在斑馬魚(yú)心臟中特異表達(dá)目的 基因的轉(zhuǎn)基因載體，本實(shí)驗(yàn)利用分子克隆的方法對(duì) 能夠在斑馬魚(yú)心臟中特異表達(dá) EGFP 報(bào)告基因的 Tol2 轉(zhuǎn)座子載體進(jìn)行了改造， 在原有的 CMLC2 啟動(dòng) 子與 EGFP 編碼區(qū)之間插入帶有多克隆位點(diǎn)的 IRES 序列， 獲得 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 轉(zhuǎn)基因表達(dá)載 體， 該載體可以實(shí)現(xiàn)在同一個(gè)啟動(dòng)子 CMLC2 的驅(qū)動(dòng) 下分別同時(shí)表達(dá)目的基因和 EGFP； 為了驗(yàn)證該表達(dá) 載體的有效性，在 CMLC2 啟動(dòng)子與 IRES 序列之間 插入 DsRed-Monomer 編碼區(qū)，將得到的表達(dá)外源基 因 DsRed-Monomer 的 重 組 載 體 pTol2CMLC2-RED-IRES-EGFP 顯微注射到斑馬魚(yú)單細(xì)胞 期胚胎中進(jìn)行表達(dá)分析：外源目的基因 (DsRed-Monomer) 和 報(bào) 告 基 因 (EGFP) 均 能 以 相 同 的 模 式 在 斑 馬 魚(yú) 心 臟 組 織 中 特 異 表 達(dá) 。 pTol2CMLC2-IRES-EGFP 轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的成功構(gòu)建為 以斑馬魚(yú)作為動(dòng)物模型，研究人類(lèi)心臟發(fā)育候選基 因在心臟發(fā)育中的功能奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法
1.1 材料
pDestTol2CG2 等質(zhì) 粒為日本國(guó) 立遺傳研究所 Kawakami 教 授 惠 贈(zèng) ， Tol2 轉(zhuǎn) 座 子 中 含 有 CCDB (Control of cell death) 基因和 CMLC2-EGFP-polyA 表達(dá)序列，其詳細(xì)的載體結(jié)構(gòu)圖見(jiàn) Kawakami 教授實(shí) 驗(yàn)室 網(wǎng)站 php/PDestTol2CG 。 pDsRed-Monomer-C1 、 pIRES2EGFP 質(zhì)粒以及大腸桿菌 DH5α 菌株為湖南師范大 學(xué)心臟發(fā)育研究中心保存。凝膠回收試劑盒、DNA 連接試劑盒、DNA 補(bǔ)平試劑盒、LA Taq DNA 聚合 酶和各種限制性?xún)?nèi)切酶為 TaKaRa 公司產(chǎn)品。大腸 桿菌 One Shot ccdB Survival Competent Cells 購(gòu)自 Invitrogen 公司，–80℃保存。條紋斑馬魚(yú)品系購(gòu)自
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中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所，28℃自動(dòng)水循環(huán) 魚(yú)缸培養(yǎng)。

以 pIRES2-EGFP 質(zhì)粒 DNA 為模板，以 IRES-F3 (5'?3')：TCCATGGTTCGAATTCTGCAGTCGACGG (下劃線(xiàn)部分為 Nco I 酶切位點(diǎn))和 IRES-R3 (5'?3')： GGTCATGATTGTGGCCATATTATCATCG ( 下 劃 線(xiàn) 部分為 BspHⅠ酶切位點(diǎn))為引物，利用 LA Taq PCR 擴(kuò)增帶有 EcoR I、 I、 Sal BamH I 等克隆位點(diǎn)的 IRES 序列，克隆到 pUM18-T 質(zhì)粒上，酶切、測(cè)序鑒定獲 得 pUM18-T/IRES 質(zhì)粒。然后用 Nco I/BspH I 雙酶 切 pUM18-T/IRES 質(zhì)粒， 回收 IRES 目的片段克隆至 pTol2-CMLC2-EGFP 質(zhì)粒中 CMLC2 啟動(dòng)子下游的 Nco I 位點(diǎn)。經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定獲得 pTol2-CMLC2IRES-EGFP 表達(dá)質(zhì)粒。

1.2

pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 多克隆位點(diǎn)表達(dá)
pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 多 克 隆 位 點(diǎn) 表 達(dá) 載

載體的構(gòu)建
體及其下游表達(dá)載體的構(gòu)建流程見(jiàn)圖 1。 pDestTol2CG2 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 One Shot ccdB Survival Competent Cells，氨卞青霉素篩選，混收菌 落，提取質(zhì)粒后用限制性?xún)?nèi)切酶 SalⅠ和 KpnⅠ切除 pDestTol2CG2 質(zhì)粒中的 CCDB 片段，回收骨架目的 片段后用 DNA 補(bǔ)平試劑盒補(bǔ)平后連接環(huán)化， 轉(zhuǎn)化大 腸桿菌 DH5α，純化得到 pTol2-CMLC2-EGFP 質(zhì)粒。

圖1

斑馬魚(yú)心臟組織特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建

Fig. 1 Construction of the zebrafish heart-specific transgenetic vector.
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1.3

pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP 表達(dá)載體的

限制性?xún)?nèi)切酶 Sal I 和 Kpn I 切除其中的 CCDB 片段， 回收骨架目的片段用 DNA 補(bǔ)平試劑盒補(bǔ)平后連接 環(huán)化 ； 限制 性?xún)?nèi) 切 酶 Sal I 的 酶 切 位點(diǎn) 在 得到 的 pTol2-CMLC2-EGFP 質(zhì)粒中并未消失，該位點(diǎn)位于 poly A 序列的下游。將帶有 EcoR I、Sal I、BamH I 等克隆位點(diǎn)的 IRES 序列正確連接到 pTol2-CMLC2EGFP 質(zhì) 粒 的 Nco I 位 點(diǎn) ， 得 到 pTol2-CMLC2IRES-EGFP 重組質(zhì)粒。本實(shí)驗(yàn)共制備了 6 個(gè)重組質(zhì) 粒 DNA，經(jīng) Sal I 酶切后電泳結(jié)果見(jiàn)圖 2，有 5 個(gè)質(zhì) 粒 酶 切 片 段 的 大 小 與 預(yù) 期 大 小 一 致 (5044 bp 和 1779 bp)。結(jié)果表明，帶有 EcoR I、Sal I、BamH I 等 克 隆 位 點(diǎn) 的 IRES 序 列 已 成 功 地 克 隆 到 pTol2-CMLC2-EGFP 質(zhì)粒中，該結(jié)果經(jīng)進(jìn)一步的測(cè) 序分析得到證實(shí)。

構(gòu)建 根據(jù)紅色熒光蛋白的表達(dá)序列，設(shè)計(jì) PCR 擴(kuò)增
引物 DSRED-F(5'?3')：GCCATGGACAACACCGAG GACGTC ( 下 劃 線(xiàn) 部 分 為 Nco I 酶 切 位 點(diǎn) ) 和 DSRED-R (5'?3')： GGAATTCTTACTACTGGGAGCC GGAGTGG (下劃線(xiàn)部分為 EcoR I 酶切位點(diǎn))。利用 引物 DSRED-F/DSRED-R，以 pDsRed-Monomer-C1 質(zhì)粒 DNA 為模板， 通過(guò) PCR 擴(kuò)增出 DsRed-Monomer 編碼序列的 DNA 片段，克隆到 pUC18-T 質(zhì)粒上，經(jīng) 酶切， 測(cè)序鑒定得到 pUC18-T/DsRed- Monomer 質(zhì)粒。 Nco I/EcoR I 雙酶切 pUC18-T/DsRed-Monomer 質(zhì) 粒后， 將回收到的 DsRed-Monomer 編碼序列的 DNA 片段克隆到 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 多克隆位點(diǎn) 表達(dá)質(zhì)粒中。經(jīng) PCR、測(cè)序鑒定獲得 pTol2-CMLC2RED-IRES-EGFP 表達(dá)質(zhì)粒。

2.2

pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP 表達(dá)載體的

1.4

斑馬魚(yú)心臟特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體的表達(dá)分析
斑馬魚(yú)受精卵的獲�。菏芫皩⒋菩塾H魚(yú)分開(kāi)

鑒定 用 引 物 DSRED-F/DSRED-R 從 質(zhì) 粒 pDsRedMonomer-C1 克隆到 DsRed-Monomer 編碼序列的 DNA 片 段 ， 經(jīng) 測(cè) 序 鑒 定 后 連 接 到 pTol2-CMLC2IRES-EGFP 表達(dá)質(zhì)粒的 Nco I/ EcoR I 位點(diǎn)，獲得 pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP 表達(dá)質(zhì)粒。 Nco I/ 用 EcoR I 雙酶切的方法鑒定獲得 pTol2-CMLC2-REDIRES-EGFP 表達(dá)質(zhì)粒，用 0.8％瓊脂糖凝膠電泳分 析雙酶切產(chǎn)物， 結(jié)果如圖 3 所示。 質(zhì)粒雙酶切后 DNA 片段的大小與預(yù)期的 DsRed-Monomer 編碼序列片段 (687 bp) 和表達(dá)載體片段 (6823 bp) 的大小一致。 結(jié) 果 表 明 ， 已 成 功 地 構(gòu) 建 了 pTol2-CMLC2-REDIRES-EGFP 表達(dá)載體，也進(jìn)一步證實(shí)了測(cè)序結(jié)果。

飼喂 2~3 d 后按 1:1~2 比例放入產(chǎn)卵池中進(jìn)行產(chǎn)卵受 精。分選和洗凈的卵移到有瓊脂糖的表面皿中，注 射外源 DNA 濃度為 0.15 ?g/?L， DNA 體積約 2 nL。 受精卵的動(dòng)物極注射完畢后，慢慢抽出注射針，將 受精卵放入裝有無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中， 使其恢復(fù)發(fā)育； 25℃~28℃培養(yǎng)胚胎，分別在 24 h、48 h、72 h 后， 熒光顯微鏡下觀察篩選心臟組織具有熒光蛋白的胚 胎個(gè)體。有綠色熒光的個(gè)體表示成功載入報(bào)告基因 EGFP 的嵌合個(gè)體。

2 結(jié)果與分析
2.1 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 多克隆位點(diǎn)表達(dá)
pDestTol2CG2 質(zhì)粒是把 Tol2 轉(zhuǎn)座子中轉(zhuǎn)座酶切 除后， CCDB (Control of cell death) 基因和 CMLC2將 EGFP-polyA 表達(dá)序列并入到 Tol2 轉(zhuǎn)座子中，其中 CCDB 基因的上游和下游均帶有同源重組臂。如果 沒(méi)有外源 DNA 片段同源重組置換 CCDB 片段， CCDB 基 因 則 會(huì) 表 達(dá) 蛋 白 ， 會(huì) 破 壞 細(xì) 菌 的 DNA gyrase，造成細(xì)菌染色體的降解導(dǎo)致細(xì)菌死亡，因此 不能轉(zhuǎn)入 DH5α 中進(jìn)行擴(kuò)增。pDestTol2CG2 質(zhì)粒經(jīng)
圖2 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP質(zhì)粒的酶切鑒定

載體的鑒定

Fig. 2 Identification of pTol2-CMLC2-IRES-EGFP plasmid by enzyme digestion. M: DNA marker; 1–6: agarose electrophoresis of the six different pTol2-CMLC2- IRES-EGFP plasmids digested with Sal I. 1, 2, 3, 4 and 6 are the positive plasmids.
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圖4 圖3 pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP 質(zhì) 粒 的 Nco I 和 EcoR I雙酶切鑒定
Fig. 3 Identification of pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP plasmids by enzyme digestion with Nco I and EcoR I. M: DNA marker; 1, 2: agarose electrophoresis of the two different pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP plasmids digested with Nco I and EcoR I. 1 and 2 are both the positive plasmids.

綠色熒光蛋白在斑馬魚(yú)心臟組織中的表達(dá)分析

Fig. 4 EGFP protein was specifically expressed in the heart tissue of the zebrafish embryos microinjected with pTol2-CMLC2-IRES-EGFP. Lateral (A) and ventral (B) side observation was performed with Nikon fluorescence microscope, and green fluorescence was detected in the heart of the zebrafish embryos using green light excitated. Ventricle marked by red arrow and atria marked by white arrow.
A B C

2.3

斑馬魚(yú)心臟特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體的表達(dá)分析
將 目 的 基 因 序 列 連 接 到 pTol2-CMLC2-

IRES-EGFP 質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn) (MCS)， 得到目的基 因的表達(dá)載體；該載體在 CMLC2 啟動(dòng)子作用下，可 以在心臟組織中特異轉(zhuǎn)錄目的基因的 mRNA； 該 mRNA 實(shí)際上也包括 IRES 轉(zhuǎn)錄序列和報(bào)告基因 EGFP 轉(zhuǎn)錄序列。因此，該 mRNA 能在細(xì)胞中翻譯 成目的蛋白和綠色熒光蛋白，綠色熒光蛋白在心臟 組織中的表達(dá)時(shí)空模式可以間接地反映外源目的蛋 白的時(shí)空表達(dá)模式。 為了分析 IRES 序列或克隆位點(diǎn) 插入的目的基因?qū)G色熒光蛋白表達(dá)的影響， pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 和 pTol2-CMLC2-REDIRES-EGFP 表達(dá)質(zhì)粒純化后顯微注射到斑馬魚(yú)單細(xì) 胞期胚胎，在 24 h 后，在熒光顯微鏡下可以觀察到 綠 色 熒 光 蛋 白 在 顯 微 注 射 了 pTol2-CMLC2-IRESEGFP 表達(dá)質(zhì)粒的斑馬魚(yú)胚胎心臟組織中特異表達(dá) (圖 4)。 顯微注射 pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP 表 達(dá)質(zhì)粒的斑馬魚(yú)胚胎心臟組織中既有紅色熒光蛋白 又有綠色熒光蛋白特異表達(dá)，且綠色熒光蛋白的時(shí) 空表達(dá)模式與紅色熒光蛋白相同；綠色熒光的熒光 強(qiáng)度比紅色熒光弱 (圖 5)。
圖 5 分析
Fig. 5 EGFP protein and RED protein were specifically and coinstantaneously expressed in the heart tissue of the zebrafish embryos microinjected with pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP. Observation of fluorescence of the heart tissue of the zebrafish embryos microinjected with pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP was performed with a Nikon fluorescence microscope. The green fluorescence (B) and red fluorescence (C) was displayed specifically and coinstantaneously in the heart tissue of the zebrafish embryos (A) microinjected and excited by blue light and red light respectively. Ventricle marked by red arrow and atria marked by white arrow.

綠色和紅色熒光蛋白在斑馬魚(yú)心臟組織中的表達(dá)

注射轉(zhuǎn)座元件的青鳉交配，后代中有約 1/5 的基因 組中帶有 GFP 基因， 表明 GFP 基因在當(dāng)代通過(guò) Tol2 的轉(zhuǎn)座整合到基因組中了。已經(jīng)有研究表明，Tol2 可攜帶長(zhǎng)達(dá) 9.7 kb 的外源標(biāo)記基因，整合到受體基 因組的染色體上 [6]。 Kwan 將 Tol2 轉(zhuǎn)座子中轉(zhuǎn)座酶編碼基因切除， 代 之 以 CMLC2-EGFP-polyA 表 達(dá) 序 列 ， 構(gòu) 建 了 pDestTol2CG2 質(zhì)粒，將該質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座酶 mRNA 一 起顯微注射斑馬魚(yú)單細(xì)胞期胚胎，觀察到斑馬魚(yú)心 臟組織中有綠色熒光蛋白特異表達(dá)，同時(shí)外源片段 整合效率高 [4]。 正如上述所言， 直接將 pDestTol2CG2 質(zhì)粒用于心臟發(fā)育候選基因的斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因載體還 有許多缺陷。內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn) (IRES) 序列來(lái)

3 討論
Koga 等 [5]將 Tol2 轉(zhuǎn)座子中 119 kb 的轉(zhuǎn)座酶編碼 基因切除，代之以 GFP 基因，將改造后的片段與轉(zhuǎn) 座酶 mRNA 一起顯微注射到基因組不含 Tol2 轉(zhuǎn)座元 件的菲律賓青鳉受精卵中。將存活的成年青鳉與未
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源于腦心肌炎病毒 [7]，它可翻譯一條 mRNA 上的兩 個(gè)開(kāi)放閱讀框，由其連接的兩個(gè)基因的表達(dá)效率相 同
[8-9]

達(dá)，綠色熒光蛋白表達(dá)時(shí)空模式可以間接地反映 RED 基因的表達(dá)時(shí)空模式。 根據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道共注射編碼轉(zhuǎn)座酶 mRNA 整合率高達(dá) 50％ [3]，在向單細(xì)胞期斑馬魚(yú)胚胎中注 射實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)曾嘗試表達(dá)質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座酶 mRNA 共注射和表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)注射兩種方法，結(jié)果表明： 表達(dá)質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座酶 mRNA 共注射和表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)注 射均能觀察到紅色熒光和綠色熒光在斑馬魚(yú)心臟組 織中特異表達(dá)，并且兩者的時(shí)空模式相同(圖 4)；且 有無(wú)轉(zhuǎn)座酶 mRNA 的顯微注射，陽(yáng)性個(gè)體之間紅色 熒光和綠色熒光在心臟組織中分布和均一性等均有 不同程度的差異，并未發(fā)現(xiàn)共注射陽(yáng)性個(gè)體的均一 性明顯優(yōu)于單獨(dú)注射陽(yáng)性個(gè)體；只是共注射編碼轉(zhuǎn) 座酶 mRNA 的斑馬魚(yú)胚胎表達(dá)紅色熒光和綠色熒光 的陽(yáng)性率高達(dá) 18％， 單獨(dú)注射 Tol2 轉(zhuǎn)座子重組表達(dá) 載體只有 3％~6％，但表達(dá)陽(yáng)性率的高低并不影響 轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的定性分析 [12]。 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 的斑 馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體引入一個(gè)多克隆位點(diǎn)片段，能 方便插入一個(gè)心臟發(fā)育候選基因；與轉(zhuǎn)座酶 mRNA 一起顯微注射斑馬魚(yú)單細(xì)胞期胚胎，Tol2 轉(zhuǎn)座子整 合效率高可以實(shí)現(xiàn)心臟發(fā)育候選基因表達(dá)序列的高 效整合， 通過(guò)熒光顯微鏡觀測(cè)報(bào)告基因 EGFP 有無(wú)表 達(dá)，即能準(zhǔn)確分析目的基因的表達(dá)情況，且方法簡(jiǎn)單 易行。因此，該載體的成功構(gòu)建對(duì)于建立心臟發(fā)育 候選基因的斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)?zāi)Ｐ途哂兄匾饬x。

。 本實(shí)驗(yàn)切除了 pDestTol2CG2 質(zhì)粒中的 CCDB

片段， 同時(shí)將帶有多克隆位點(diǎn)的 IRES 片段克隆到質(zhì) 粒中 CMLC2 啟動(dòng)子下游的 Nco I 位點(diǎn)。改造后的表 達(dá)質(zhì)粒 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 在斑馬魚(yú)心臟組 織中有綠色熒光蛋白特異表達(dá) (圖 4)；同時(shí)，綠色 熒光在心房和心室中表達(dá)的強(qiáng)度有差異，心室熒光 信號(hào)很強(qiáng)，而心房的熒光信號(hào)很弱；該結(jié)果與其他 文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致 ，這種情況可能是與 CMLC2 啟動(dòng)子特性有關(guān)
[10] [4]

。因此，插入 IRES 片段后對(duì)綠

色熒光蛋白特異表達(dá)沒(méi)有影響。 根據(jù)基因工程原理將目的基因和報(bào)告基因 (如 EGFP) 通過(guò) IRES 序列連接起來(lái)，兩個(gè)基因在同一 個(gè)啟動(dòng)子作用下轉(zhuǎn)錄成單鏈 mRNA，但翻譯時(shí)又是 相互獨(dú)立的，不會(huì)形成嵌合蛋白 [8-9]，保證了目的基 因蛋白的生物活性，并且理論上只要有報(bào)告基因 (如 EGFP) 的表達(dá)，目的基因也肯定會(huì)表達(dá)，因此 便于通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因 EGFP 的表達(dá)來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因 生物個(gè)體的篩選
[11]

。對(duì)于 pTol2-CMLC2-RED-IRES-

EGFP 表達(dá)質(zhì)粒來(lái)說(shuō)，在 CMLC2 啟動(dòng)子作用下，在 心臟組織中特異轉(zhuǎn)錄目的基因 DsRed-Monomer 的 mRNA 實(shí)際上也包括 IRES 轉(zhuǎn)錄序列和報(bào)告基因 EGFP 轉(zhuǎn)錄序列。該 mRNA 能在細(xì)胞中翻譯出目的 蛋白——紅色熒光蛋白和報(bào)告基因蛋白——綠色熒 光蛋白；EGFP 蛋白與 DsRed-Monomer 蛋白的編碼 框是獨(dú)立的，均有各自的起始位點(diǎn) ATG 和終止位點(diǎn) TGA 或 TAA 等，核糖體與該 mRNA 的 5′端前導(dǎo)序 列結(jié)合翻譯成目的蛋白——紅色熒光蛋白后脫離， 同時(shí)，核糖體也可以與該 mRNA 的 IRES 序列結(jié)合 翻譯下游的綠色熒光蛋白。因此，在細(xì)胞中紅色熒 光蛋白和綠色熒光蛋白是兩個(gè)獨(dú)立蛋白，而不是融 合蛋白。同時(shí)，只要有綠色熒光蛋白的表達(dá)就可以 證明 IRES 在斑馬魚(yú)胚胎中的有效性。 將質(zhì)粒純化后 顯微注射到斑馬魚(yú)單細(xì)胞期胚胎，24 h 后，在熒光 顯微鏡下觀察斑馬魚(yú)胚胎心臟組織中紅色熒光蛋白 和綠色熒光蛋白均同時(shí)特異表達(dá)，，綠色熒光的熒光 強(qiáng)度比紅色熒光弱 (圖 5)。因此，在 CMLC2 啟動(dòng)子 的驅(qū)動(dòng)下，與 IRES 序列相連接的雙基因可同時(shí)表

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Journals.im.ac.cn

gene

trap

approach

identifies

developmentally regulated genes in zebrafish. Dev Cell,

236

ISSN1000-3061

CN11-1998/Q

Chin J Biotech

February 25, 2010

Vol.26

No.2

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科學(xué)出版社科學(xué)出版中心生命科學(xué)分社新書(shū)推介
植物光合、蒸騰與水分利用的生理生態(tài)學(xué)
于貴瑞 王秋鳳 等著 978-7-03-026045-1 ￥128.00 2010 年 1 月 出版 本書(shū)以氣孔行為控制的植物光合、蒸騰和水分利用為主線(xiàn), 系統(tǒng)地論述了植物光 合、蒸騰和水分利用的生理生態(tài)學(xué)基礎(chǔ), 介紹了生態(tài)系統(tǒng)的光合、蒸騰和水分利用效率 變化特征及其模型模擬的基礎(chǔ)知識(shí)和主要的研究進(jìn)展。本書(shū)在論述生物圈與其他圈層 間關(guān)系的基礎(chǔ)上, 著重論述了植物的氣孔行為及氣孔導(dǎo)度的模擬模型, 植物光合作用 及其模擬方法, 植物蒸騰及其模擬方法, 植物的水分利用及其模擬模型, 以及基于植 物光合、蒸騰和水分利用相互作用關(guān)系的生態(tài)系統(tǒng)碳、水和能量平衡綜合模型。 本書(shū)是作者研究團(tuán)隊(duì)多年科研工作的總結(jié), 歸納分析了國(guó)內(nèi)外本研究領(lǐng)域的重要 進(jìn)展, 其目的是為國(guó)內(nèi)從事相關(guān)領(lǐng)域研究的科技人員提供關(guān)于植物光合、 蒸騰和水分利 用效率方面的參考資料,本書(shū)也可作為相關(guān)領(lǐng)域的研究生基礎(chǔ)教材。

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  本文關(guān)鍵詞：利用Tol2轉(zhuǎn)座子構(gòu)建斑馬魚(yú)心臟組織特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體及其表達(dá)分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。