本文關(guān)鍵詞：帶npt-Ⅱ基因轉(zhuǎn)基因水稻快速檢測技術(shù)的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

以轉(zhuǎn)溶菌酶基因水稻純系材料中花9號(hào)(ZH9(R))及其受體品種中花9號(hào)(ZH9(CK))為材料, 以ZH9(R)中攜帶的npt-Ⅱ基因作為輔助篩選標(biāo)記, 利用抗生素對(duì)其進(jìn)行處理, 建立了一套快速檢測帶npt-Ⅱ基因轉(zhuǎn)基因水稻的技術(shù)體系。使用不同濃度的卡那霉素(Kanamycin, Kan)和G418溶液將ZH9(R)和Z

504 HEREDITAS (Beijing) 2007

第29卷

表5 水稻幼苗對(duì)G418敏感性的測定結(jié)果

Table 5 Sensivity result of G418 testing young seedlings of ZH9(R) and ZH9 (CK)

4天 (4 day) 8天 (8 day) 12天 (12 day) G418

(mg/L) ZH9(R) ZH9(CK) ZH9(R) ZH9(CK) ZH9(R) ZH9(CK)

0 100 150 200 250 整株枯死。

+++ +++

60, 跟80 mg/L G418條件下的檢測結(jié)果完全一致, 適合大田中成株離體葉片的快速檢測; 在驗(yàn)證種子快速檢測方法中, 發(fā)現(xiàn)PCR呈陽性的種子有60粒, 占整個(gè)存活種子的92.31%, 適合大批量種子的快速檢測; 在驗(yàn)證幼胚快速檢測方法中, 發(fā)現(xiàn)PCR呈陽性的幼胚有60顆, 占整個(gè)存活幼胚的89.55%, 適合室內(nèi)幼胚的快速檢測; 在驗(yàn)證幼苗快速檢測方法中, 發(fā)現(xiàn)PCR呈陽性的幼苗也是60株, 占整個(gè)存活幼苗的96.77%, 適合室內(nèi)組培苗的快速檢測。

2.7 應(yīng)用G418快速檢測ZH9(R)轉(zhuǎn)育后代群體結(jié)

果分析

+ +

++ ++

+ + +++ ++ ++++

: 無變化; +: 葉尖開始卷曲; ++: 葉面開始變黃; +++: 整株黃化; ++++:

: Shows no variation; +: Shows needles begin to curl; ++: Show

leaves are yellow; +++: Show the plants are yellow; ++++: Shows plants are dead.

臨界濃度。 2.6 PCR檢測結(jié)果

將G418(溶液或培養(yǎng)基)篩選獲得的ZH9(R)和ZH9(CK)混合群體陽性葉片對(duì)應(yīng)的植株葉片60份、種子萌芽篩選后的存活苗65株、幼胚萌芽篩選后的存活苗67株和幼苗篩選后的62株分別提取的DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增(表6、圖1), 結(jié)果表明, 已擴(kuò)增出了與npt-Ⅱ基因的和溶菌酶基因序列長度完全一致DNA特征帶, 且二者結(jié)果完全相符, 這說明npt-Ⅱ基因和溶菌酶基因是緊密連鎖遺傳的。

在驗(yàn)證葉片快速檢測方法中, 通過對(duì)60株成株所提DNA的PCR檢測結(jié)果分析, 發(fā)現(xiàn)陽性株數(shù)為

2.7.1 應(yīng)用G418快速檢測ZH9(R)轉(zhuǎn)育回交后代

群體葉片

應(yīng)用本研究建立的npt-Ⅱ標(biāo)記基因葉片快速檢測方法用80 mg/L濃度的G418溶液對(duì)9311/ZH9(R)、MH63/ZH9(R)、PA64s/ZH9(R)、288/ZH9(R)、E32/ ZH9(R)的BC1F1代和9311/ZH9(R)、MH63 /ZH9(R)、PA64s/ZH9(R)的BC2F1代群體葉片進(jìn)行單株抗性鑒定, 4天后, 效果非常明顯, 經(jīng)χ2測驗(yàn), 回交后代抗性株與敏感株的分離比約為1︰1(表7)。

2.7.2 應(yīng)用G418快速檢測ZH9(R)轉(zhuǎn)育回交后代 和回交自交后代群體種子

應(yīng)用種子快速檢測方法用300 mg/L G418溶液篩選9311/ZH9(R)和MH63/ZH9(R)的BC3F1代群體

表6 npt-Ⅱ基因和溶菌酶基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

Table 6 PCR amplification result of npt-Ⅱand lysozyme gene

PCR檢測結(jié)果 PCR result

npt-Ⅱgene Lysozyme gene

陽性 Positive 陰性Negative 陽性Positive 陰性Negative

葉片檢測數(shù) No. of the tested

leaves

種子檢測數(shù) No. of the tested

seeds

幼胚檢測數(shù) No. of the tested young embryos

幼苗檢測數(shù) No. of the tested young seedlings

60 60 60 60 60 60

60 60

0 5 7 2

0 5 7 2

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

1~11: npt-Ⅱ基因擴(kuò)增; 12~22: 溶菌酶基因擴(kuò)增。1、22: 質(zhì)粒; 2~11: ZH9(R); 12~21: ZH9(CK)。

Fig. 1 PCR amplification results

1-11: npt-Ⅱgene, 12-22: Lysozyme gene.1,22: Plasmid; 2-11: ZH9(R); 12-21: ZH9(CK).

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