發(fā)布時間：2025-06-24 02:51

　　在高等生物的免疫系統(tǒng)中,先天免疫系統(tǒng)與后天免疫系統(tǒng)相互協(xié)作,共同抵御著外源病原體入侵以及維持機體健康。先天免疫作為防御外源病原體入侵的第一道防線,更是首當其沖,不可或缺的。而在先天免疫中,干擾素作為其中的一類高活性的天然糖蛋白,在抗病毒、抗增生以及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。目前發(fā)現(xiàn)的先天免疫通路中包括TLR、RIG-I以及cGAS-STING通路都會在機體受到相應(yīng)的病原體相關(guān)分子模式的刺激下誘導產(chǎn)生Ⅰ型干擾素,從而發(fā)揮抗病抗毒作用。此外還有研究表明IFNβ對于腫瘤的治療有一定的幫助。干擾素作為天然免疫應(yīng)答的重要指示劑,檢測其表達位點以及水平顯得尤為重要。然而,干擾素只在一些類細胞中表達,一旦釋放到血液中后將被稀釋,使得檢測的靈敏度要求較高。另一方面,由于綠色熒光背景較高,不方便準確觀察,為此我們選擇紅色熒光mCherry來作為由IFNβ啟動子誘導表達蛋白轉(zhuǎn)來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型。我們利用已經(jīng)優(yōu)化截短后的IFNβ啟動子連接mCherry蛋白并在細胞水平驗證了其可行性。然后將Sleeping beauty轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)的質(zhì)粒通過顯微注射到小鼠胚胎中,將注射后的胚胎移植到假孕母鼠中,通過對子...

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖2.3.1.1 HT-DNA、c GAMP、POLY(I:C)、LPS和HSV-1處理L929后IFNβmRNA表達量

在我們利用HT-DNA、cGAMP、POLY(I:C)、LPS和HSV-1處理細胞后,qPCR結(jié)果顯示IFNβ對于HT-DNA、cGAMP、POLY(I:C)的響應(yīng)較為強烈,對LPS沒有響應(yīng),是因為LPS在細胞內(nèi)的主要受體是TLR4,而我們使用的L929細胞不表達TLR4,所以....

圖2.3.2 HT-DNA、c GAMP和POLY(I:C)刺激L929后p-IRF3的表達

HT-DNA在進入細胞后會被cGAS識別并結(jié)合到cGAS上,cGAS以ATP和GTP為底物合成第二信使cGAMP,cGAMP結(jié)合STING后招募下游的TANK結(jié)合激酶1(TANK-bindingkinase1,TBK1),從而促進干擾素調(diào)節(jié)因子3(IFNregula....

圖2.3.3.1 IFNβ刺激L929后的ISG15(A)and IFIT1(B)mRNA相對表達量

我們先將IFNβ蛋白稀釋成四個梯度濃度,我們?nèi)∵@四個以上各濃度的IFNβ蛋白加入到被1mL培養(yǎng)基覆蓋的L929細胞中,最終IFNβ的工作濃度為2.5ng/mL、25ng/mL、250ng/mL和6h后提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,qPCR結(jié)果表明不同濃度的IFNβ蛋....

圖2.3.3.2不同濃度IFNβ對HSV-1的抵抗效果

同時,我們在L929細胞中檢測了干擾素對HSV-1感染的抑制效果。我們將IFNβ的最終工作濃度為定為2.5ng/mL、25ng/mL和250ng/mL。6小時后添加HSV-1病毒進行感染。分別在24h,48h,72h觀察細胞狀態(tài)并計算細胞活率。結(jié)果表明在終濃度為2.5....

本文編號：4052381