發(fā)布時間：2024-09-17 17:34

　　 【背景】檸檬酸合成酶是碳代謝途徑的中心酶,其在三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle,TCA)、氨基酸合成和乙醛酸循環(huán)中發(fā)揮著重要作用,是檸檬酸合成的關鍵酶。本論文所選用的是一株高產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉菌株CGMCC10142�！灸康摹靠寺�檸檬酸合成酶關鍵基因,構建檸檬酸合成酶的敲除菌株并鑒定其在黑曲霉菌株高產(chǎn)檸檬酸過程中的功能及影響�！痉椒ā坎捎酶�癌農(nóng)桿菌轉化方法并利用同源重組原理,采用抗性篩選和致死型反向篩選的雙重篩選方法獲得正確敲除株。對轉化子在不同碳源下的生長情況進行觀察并對檸檬酸發(fā)酵過程中菌絲球變化和產(chǎn)酸量進行分析,最后通過熒光定量PCR分析檸檬酸合成酶基因對黑曲霉積累檸檬酸的影響,及其對主要代謝途徑中重要酶相關基因和其他的表達量的影響�！窘Y果】以檸檬酸高產(chǎn)菌株黑曲霉CGMCC10142為出發(fā)菌,構建一株遺傳穩(wěn)定的檸檬酸合成酶敲除的菌株T1-2。結果發(fā)現(xiàn)該菌株在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上生長緩慢并且產(chǎn)生孢子量減少。通過搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸實驗,結果表明敲除菌在84 h產(chǎn)酸量為64.3 g/L,相對于出發(fā)菌的98.7g/L降低了34.85%。通過熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)檸檬酸合...

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【部分圖文】：

圖14個檸檬酸合成酶的氨基酸序列比對

基于對CGMCC10142基因組的分析，該菌株具有4個編碼檸檬酸合成酶的基因。4個檸檬酸合成酶的氨基酸序列比對如圖1所示，差異較大，但依然具有活性位點和乙酰輔酶A的結合位點。分別將黑曲霉4個檸檬酸合成酶的氨基酸序列與不同物種的檸檬酸合成酶比較發(fā)現(xiàn)，第4個檸檬酸合成酶(An09g0....

圖2檸檬酸合成酶cs基因的克隆

圖14個檸檬酸合成酶的氨基酸序列比對2.2cs基因缺失菌株的構建

圖3不同物種的檸檬酸合成酶的氨基酸序列比對

由于自身基因的缺失和外源基因的隨機插入都會導致黑曲霉的生長形態(tài)發(fā)生改變(圖6)。從菌落形態(tài)可以看出，兩株菌以葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖為單一碳源時菌落較大，以阿拉伯糖、乳糖、乙酸鈉、丙酸鈉為唯一碳源時的菌落較小。從產(chǎn)孢情況來看，黑曲霉CGMCC10142在葡萄糖和半乳糖為唯....

圖4對不同物種檸檬酸合成酶構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3不同物種的檸檬酸合成酶的氨基酸序列比對圖5敲除株質粒構建過程和陽性轉化子的驗證

本文編號：4005799