發(fā)布時間：2025-06-23 22:25

　　 目的建立陣列式標簽標記的高通量測序方法并結(jié)合多克隆預(yù)篩選實現(xiàn)對點突變單克隆細胞株的高效鑒定。方法通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組修復(fù)(HDR)在K562細胞的rs826415位點引入G到T點突變。侯選細胞按每孔10～20個的密度接種培養(yǎng)多克隆,以帶有標簽(barcode)的引物區(qū)分各多克隆細胞,PCR擴增含rs826415位點的區(qū)段,產(chǎn)物合并進行二代測序。生物信息學(xué)分析各多克隆細胞的同源重組率及插入/缺失率。將陽性率最高孔內(nèi)的細胞進一步單克隆培養(yǎng)并鑒定基因型。結(jié)果通過CRISPR/Cas9同源重組法和有限稀釋獲得96個rs826415位點打靶的多克隆細胞。經(jīng)陣列式標簽高通量測序法分析各孔細胞同源重組且不伴隨插入/缺失(HDR without indel)的比率,96個多克隆的平均陽性率為0.21%,最高達4.35%,將該多克隆細胞進一步單克隆培養(yǎng),從30個單克隆中成功獲得rs826415位點由G/G突變?yōu)門/G的雜合型細胞株。結(jié)論通過陣列式標簽高通量測序策略結(jié)合多克隆細胞預(yù)篩選,實現(xiàn)了定點突變單克隆細胞株的高效鑒定,相比常規(guī)方法顯著降低了工作量和成本。

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

圖2 陣列式標簽PCR擴增法構(gòu)建rs826415位點打靶的多克隆K562細胞二代測序文庫

圖1利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組在K562rs826415位點引入G到T點突變2.5單克隆突變細胞的篩選鑒定

圖3 二代測序分析篩選陽性率最高的rs826415位點打靶K562細胞多克隆

CRIPSR/Cas9系統(tǒng)為基因編輯提供了有效的工具,但其介導(dǎo)同源重組獲得精確編輯的點突變細胞效率仍然偏低,相對早期胚胎和干細胞來說,體細胞中的編輯效率更低,常在1%以下[3],因而需要篩選大量細胞以獲得陽性克隆。篩選過程中由于轉(zhuǎn)染和流式分選等引起細胞損傷、單細胞不易增殖及流式分....

圖4 Sanger測序鑒定rs826415位點成功G到T點突變的K562單克隆細胞株

目前本研究只獲得了雜合型的定點突變克隆,為提高精確基因編輯的純合型細胞得率可采取添加非同源末端連接(non-homologousendjoining,NHEJ)抑制劑,使用Cas9的不同變體[2]、CRISPR核糖核蛋白[CRISPRribonucleoprotein(R....

圖1 利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組在K562 rs826415位點引入G到T點突變

陣列式標簽PCR擴增的混合文庫首先通過Agilent2100Bioanalyzer進行質(zhì)量控制檢查,檢測結(jié)果顯示文庫主帶在431bp左右,產(chǎn)物大小合適,沒有小片段污染,說明文庫建庫質(zhì)量合格(圖3A),雙端測序(2×150bp)后分析每孔多克隆細胞的同源重組率和插入缺失率。....

本文編號：4052086