NLRC3通過(guò)抑制TRAF6-K63泛素化減輕RAW264.7細(xì)胞缺氧復(fù)氧炎性反應(yīng)的作用機(jī)制研究
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R657.3
【部分圖文】：
重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文21圖1小鼠肝臟I/R處理后不同再灌注時(shí)間點(diǎn)血清IL-1β和肝組織NLRC3的表達(dá)變化Fig1TheconcentrationofIL-1βinmiceserumandexpressionofNLRC3inmicelivertissuesatdifferentreperfusiontimepointafterliverI/RtreatmentA：小鼠肝I/R模型中血清IL-1β含量；B：肝組織NLRC3蛋白水平；C:半定量分析肝組織NLRC3的蛋白表達(dá)。aP＜0.05vs假手術(shù)組。A：IL-1βserumlevelinmiceafterI/Rstimuli;B:TheNLRC3proteinlevelinliversfrommicesubjectedtoshamtreatmentorischemiafor1hfollowedbyreperfusionfortheindicatedtime;C:Semi-quantitativeanalysisofNLRC3proteinlevelineachgroup.aP＜0.05vsSham.2.2H/R處理后，細(xì)胞內(nèi)NLRC3和NF-κB的表達(dá)改變結(jié)合本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[20]，在該項(xiàng)研究中我們構(gòu)建了缺氧12h，復(fù)氧時(shí)間梯度為R0h、R1h、R2h、R3h、R6h、R9h的RAW264.7細(xì)胞H/R炎癥模型。Westernblot結(jié)果示，與R0h組相比，細(xì)胞內(nèi)NLRC3和IκBα蛋白表達(dá)隨復(fù)氧時(shí)間延長(zhǎng)而下降，而p-p65/p65比值隨復(fù)氧時(shí)間延長(zhǎng)而增高（aP＜0.05）。結(jié)果表明，在RAW264.7細(xì)胞H/R模型復(fù)氧早期，NF-κB信號(hào)活化水平增高的同時(shí)NLRC3蛋白表達(dá)呈降低趨勢(shì)（圖2）。
重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文22圖2H/R處理后，不同復(fù)氧時(shí)間點(diǎn)RAW264.7細(xì)胞中NLRC3與NF-κB的蛋白表達(dá)改變Fig2TheproteinexpressionlevelsofNLRC3andNF-κBsignalinginRAW264.7cellsafterH/RtreatmentofindicatedreoxygenationtimepointA:NLRC3、p-p65、p65、IκBα的蛋白表達(dá);B-D:NLRC3、p-p65/p65、IκBα蛋白水平的半定量分析。aP＜0.05vsR0h組。A:TheproteinlevelsofNLRC3、p-p65、p65andIκBα;B-D:Semi-quantitativeanalysisofNLRC3、p-p65/p65、IκBαproteinlevelineachgrouprespectively.aP＜0.05vsR0h.2.3H/R處理后，細(xì)胞內(nèi)TRAF6及其K63泛素化水平的表達(dá)改變采用免疫沉淀聯(lián)合印跡技術(shù)檢測(cè)經(jīng)缺氧12h，復(fù)氧0h、1h、2h、3h、6h、9h后的各組細(xì)胞內(nèi)TRAF6蛋白及其K63泛素化水平。結(jié)果顯示，與R0h組相比較，隨復(fù)氧時(shí)間增加，除外R1h升高程度組間差異不顯著，其余各組TRAF6蛋白表達(dá)及其K63泛素化水平均顯著增高（aP＜0.05）。結(jié)合2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們初步分析在RAW264.7細(xì)胞H/R模型中，NLRC3和TRAF6的蛋白表達(dá)可能呈負(fù)向變化趨勢(shì)。在此，我們選擇缺氧12h繼而復(fù)氧9h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞H/R模型的標(biāo)本獲取和檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)（圖3）。
重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文23圖3H/R處理后，不同復(fù)氧時(shí)間點(diǎn)RAW264.7細(xì)胞中TRAF6及其K63泛素化水平的蛋白表達(dá)改變Fig3ImmunoblotanalysisoftheTRAF6anditsK63-linkedubiquitinationexpressioninRAW264.7cellsafterH/RtreatmentofindicatedreoxygenationtimepointA:RAW264.7細(xì)胞內(nèi)TRAF6及其K63泛素蛋白表達(dá)；B:TRAF6蛋白半定量結(jié)果；C:TRAF6-K63泛素蛋白半定量結(jié)果。aP＜0.05vsR0h組。A:IPcombiningimmunoblottinganalysesofTRAF6anditsK63ubiquitinproteinlevels;B:RelativeexpressionlevelofTRAF6;C:RelativeexpressionlevelofTRAF6-K63ubiquitinprotein.aP＜0.05vsR0h.2.4NLRC3與TRAF6的生理性相互結(jié)合采用Co-IP實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)RAW264.7細(xì)胞處于生理穩(wěn)態(tài)時(shí)NLRC3與TRAF6分子的相互結(jié)合情況進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用TRAF6抗體沉淀的蛋白提取物上樣電泳，轉(zhuǎn)膜后孵育NLRC3抗體，曝光顯影能檢測(cè)到NLRC3蛋白，且用NLRC3抗體沉淀的蛋白提取物中也能檢測(cè)到TRAF6蛋白，同時(shí)，IgG陰性對(duì)照組均未檢測(cè)到TRAF6和NLRC3蛋白表達(dá)，Lysate陽(yáng)性對(duì)照組中可檢測(cè)到二者的蛋白表達(dá)
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