發(fā)布時(shí)間：2025-01-20 17:44

　　目的:研究大分子擁擠環(huán)境對(duì)不同糖基化程度的黏蛋白(MUC5AC)在復(fù)性過(guò)程中折疊和聚集的差異效應(yīng)。方法:首先將含有目的基因片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293細(xì)胞誘導(dǎo)MUC5AC的表達(dá),并用鎳離子親和層析柱純化目的蛋白。用肽N-糖苷酶F(PNGase F)處理純化的MUC5AC進(jìn)行酶切去糖基化,聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)去糖基化結(jié)果。利用蛋白擁擠試劑牛血清白蛋白(BSA)以及多糖擁擠劑聚乙二醇2000(PEG2000)、聚蔗糖70(Ficoll70)和葡聚糖70(Dextran70)在體外模擬生物體內(nèi)的大分子擁擠環(huán)境,設(shè)置擁擠試劑質(zhì)量濃度梯度為50g/L、100 g/L和200 g/L,用不含擁擠試劑的緩沖液作為對(duì)照組。將鹽酸胍(GdnHCl)誘導(dǎo)變性的去糖基化蛋白(d-MUC5AC)及未去糖基化的天然蛋白(n-MUC5AC)分別加入到上述四種大分子擁擠試劑和對(duì)照組緩沖液中復(fù)性,25℃條件下用紫外分光光度計(jì)連續(xù)監(jiān)測(cè)復(fù)性過(guò)程中各組蛋白在488nm處吸光度的變化。復(fù)性終產(chǎn)物離心后測(cè)定上清液中可溶性蛋白質(zhì)濃度,分析不同復(fù)性體系中蛋白質(zhì)的復(fù)性產(chǎn)率結(jié)果:兩種蛋白在質(zhì)量濃度較高(ρ=200 g/L)的擁擠條件下...

【文章頁(yè)數(shù)】：49 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖1重組MUC5AC在HEK293中的表達(dá)純化

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文18P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1重組MUC5AC在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)純化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72h后，收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，然后用Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行純化，流出液經(jīng)SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色鑒定蛋白純化結(jié)果。S....

圖2染色分析MUC5AC去糖基化結(jié)果

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文19由40kDa下移至17kDa左右。PAS染色結(jié)果顯示，僅n-MUC5AC在40kDa處顯色，PNGaseF處理后的蛋白未見(jiàn)顯色，說(shuō)明在HEK293細(xì)胞中表達(dá)的n-MUC5AC進(jìn)行了N-糖基化修飾，而經(jīng)PNGaseF糖苷酶消化后糖基基團(tuán)已基本被去處....

圖3不同質(zhì)量濃度的大分子擁擠試劑對(duì)n-MUC5AC復(fù)性產(chǎn)率的影響

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文20子擁擠試劑的質(zhì)量濃度ρ選在50或100g/L時(shí)兩種蛋白質(zhì)均能很好的復(fù)性，由于生物體內(nèi)的大分子濃度高達(dá)80～400g/L[13-15]，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用ρ=100g/L作為最適質(zhì)量濃度。圖3不同質(zhì)量濃度的大分子擁擠試劑對(duì)n-MUC5AC復(fù)性產(chǎn)率的影....

圖4.不同質(zhì)量濃度的大分子擁擠試劑對(duì)d-MUC5AC復(fù)性產(chǎn)率的影響

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文20子擁擠試劑的質(zhì)量濃度ρ選在50或100g/L時(shí)兩種蛋白質(zhì)均能很好的復(fù)性，由于生物體內(nèi)的大分子濃度高達(dá)80～400g/L[13-15]，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用ρ=100g/L作為最適質(zhì)量濃度。圖3不同質(zhì)量濃度的大分子擁擠試劑對(duì)n-MUC5AC復(fù)性產(chǎn)率的影....

本文編號(hào)：4029458