發(fā)布時間：2018-01-05 06:21

  本文關鍵詞：穴位埋線對衰老模型大鼠海馬自噬的影響　出處：《廣州中醫(yī)藥大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的:從行為學、形態(tài)學、分子生物學三個環(huán)節(jié),通過觀察大鼠一般狀態(tài)、體重、曠場實驗、水迷宮定位航行試驗及空間探索試驗,海馬神經(jīng)元HE染色、海馬神經(jīng)元尼氏染色、海馬神經(jīng)元透射電鏡超微結構,海馬神經(jīng)元mTOR信號通路中ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62mRNA 以及p-mTOR、ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62 蛋白等指標,從自噬角度闡明衰老的機制及慢性應激促進衰老的機理,為延緩衰老提供新的思路和理論依據(jù);基于mTOR信號通路闡明穴位埋線影響復合衰老模型大鼠海馬自噬功能的機制,為中醫(yī)藥延緩衰老的臨床應用提供實驗依據(jù)。方法:按照體重排序,采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件將實驗動物隨機分為組空白對照、模型一組(D-半乳糖腹腔注射)、模型二組(復合衰老模型)、穴位埋線組、假埋線組,每組12只�？瞻讓φ战M僅給予6周腹腔注射生理鹽水。模型一組僅給予6周腹腔注射D-半乳糖(120mg/Kg/d)。模型二組給予6周腹腔注射D-半乳糖(120mg/Kg/d),同時從第3周開始給予慢性應激,共應激4周。穴位埋線組給予6周腹腔注射D-半乳糖(120mg/Kg/d),同時從第3周開始給予慢性應激,應激方式同模型二組,共應激4周。從第一周開始,每周埋線一次,共6次。假埋線組組給予6周腹腔注射D-半乳糖(120mg/Kg/d),同時從第3周開始給予慢性應激,應激方式同模型二組,共應激4周。從第一周開始,每周假埋線一次,共6次。埋線處方:選取"腎俞(雙)"、"足三里(雙)"、"百會"、"太沖(雙)"作為穴位埋線處方。"腎俞(雙)"、"百會(雙)" 一組,"太沖"和"足三里(雙)" 一組,兩組交替埋線。實驗過程中,觀察大鼠毛發(fā)飲食精神活動情況等一般狀態(tài)。于實驗前、3周后、實驗結束(6周)后稱量各組大鼠的體重。實驗結束后,進行行為學實驗--反映衰老大鼠自主活動能力的曠場實驗及反映學習認知記憶能力的水迷宮實驗。行為學結束后立馬取材,通過HE染色及尼氏染色檢測觀察大鼠海馬的一般病理形態(tài)結構;通過電鏡檢測觀察海馬的超微結構;qPCR法檢測海馬中ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62 mRNA的表達;蛋白印記法(westernblot)檢測海馬中p-mTOR、ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白的表達。結果:1.各組大鼠一般狀態(tài)改變模型一組、模型二組、假埋線組大鼠經(jīng)過造模后,毛發(fā)凌亂晦暗、反應遲鈍、精神倦怠少動、飲食量減少、耳廓無光澤,且模型二組、假埋線組老化現(xiàn)象更明顯。穴位埋線組的老化現(xiàn)象得到明顯改善。2.各組大鼠體重結果在造模期間,各組大鼠體重均有增長�？瞻讓φ战M及模型一組的體重增長速度最快,穴位埋線組大鼠的體重增長較空白對照組緩慢,模型二組及假埋線組大鼠體重增長最慢。3.各組大鼠曠場實驗結果與空白對照組相比,模型一組、模型二組、假埋線組大鼠曠場實驗活躍度、中央?yún)^(qū)路程、中央?yún)^(qū)時間、總路程均減少(P0.05),且模型二組及假埋線組較模型一組有升高或升高趨勢。與模型二組相比,穴位埋線組大鼠曠場實驗活躍度、中央?yún)^(qū)路程、中央?yún)^(qū)時間、總路程均增加(P0.05)4.各組大鼠水迷宮實驗結果經(jīng)過四天的定位航行試驗訓練,各組大鼠的逃避潛伏期均明顯減少,其中空白對照組及穴位埋線組變化趨勢最明顯,模型一組次之,模型二組及假埋線組大鼠逃避潛伏期變化趨勢最緩慢。在定位航行試驗第四天,各組大鼠逃避潛伏期顯示明顯差異,與空白對照組相比,模型二組及假埋線組大鼠逃避潛伏期均升高(P0.05),模型一組逃避潛伏期有升高趨勢(P0.05);與模型一組相比,模型二組及假埋線組逃避潛伏期有升高趨勢(P0.05);與模型二組相比,穴位埋線組大鼠逃避潛伏期降低(P0.05);與穴位埋線組相比,假埋線組大鼠逃避潛伏期升高(P0.01)。與空白對照組相比,模型一組、模型二組及假埋線組穿越平臺次數(shù)減少(P0.05);穴位埋線組穿越平臺次數(shù)較之模型一組、模型二組及假埋線組有升高趨勢(P0.05);模型一組、模型二組及假埋線組三組之間穿越平臺次數(shù)進行兩兩比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.各組大鼠海馬HE染色結果空白對照鼠海馬區(qū)神經(jīng)元豐富,結構正常,細胞排列整齊緊密。模型一組、模型二組、假埋線組海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)目減少,排列紊亂,細胞間隙增大,細胞萎縮,且模型二組、假埋線組的病變程度比模型一組嚴重。穴位埋線組海馬區(qū)神經(jīng)元排列稍疏松,尚整齊,少量神經(jīng)元萎縮,細胞數(shù)量無明顯減少。6.各組大鼠海馬尼氏染色結果空白對照組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元結構正常尼氏體清晰、豐富。模型一組、模型二組、假埋線組大鼠海馬神經(jīng)元排列紊亂,細胞間隙增大,尼氏體減少,且模型二組、假埋線組的病變程度比模型一組嚴重,尼氏體減少甚至消失。穴位埋線組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元排列還算整齊,但輕度疏松,細胞間隙稍增大,尼氏體清晰。7.各組大鼠海馬電鏡超微結構結果空白對照組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞核,線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器結構均正常有自噬小體的存在;未觀察到脂褐素;突觸體數(shù)量多且大,微管結構豐富。模型一組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞核異形,線粒體數(shù)量減少、腫脹變性;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列紊亂,甚至出現(xiàn)脫顆�，F(xiàn)象;自噬小體數(shù)量較之空白對照組明顯增多;突觸體數(shù)量減少,體積縮小,樹突內(nèi)微管和微絲結構存在溶解現(xiàn)象;脂褐素沉積增多。模型二組及假埋線組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結構損傷均較模型一組嚴重,自噬小體增多。穴位埋線組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結構大致正常,細胞核呈圓形,核膜完整,核仁明顯,染色質(zhì)數(shù)量多且分布均勻;線粒體數(shù)量尚可,偶有線粒體嵴不規(guī)則甚至消失,無空泡樣變性;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶有脫顆粒現(xiàn)象;可見自噬小體;突觸體結構數(shù)量基本正常,樹突中微管微絲結構大致正常8.各組大鼠海馬ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62mRNA的表達結果與空白對照組相比,模型一組海馬LC3-Ⅱ、P62mRNA表達升高(P0.05),ULK1、Beclin1mRNA 的表達有升高趨勢(P0.05);模型二組 ULK1、LC3-Ⅱ、P62mRNA表達升高(P0.05),Beclin1 mRNA的表達有升高趨勢(P0.05)。與模型一組相比,模型二組海馬 LC3-Ⅱ mRNA、P62 mRNA 表達升高(P0.05),ULK1、Beclin1 mRNA的表達有升高趨勢(P0.05)。與模型二組相比,穴位埋線組海馬ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62 mRNA表達均降低(P0.01)。與穴位埋線組相比,假埋線組海馬ULK1、Beclin1mRNA、LC3-Ⅱ、P62mRNA 表達升高(P0.05)。9.各組大鼠海馬p-mTOR、ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表達結果與空白對照組相比,模型一組大鼠海馬神經(jīng)元P62、Beclin1蛋白的表達有升高趨勢(P0.05),LC3-Ⅱ、ULK1 蛋白表達升高(P0.05),p-mTOR 表達降低(P0.01);模型二組LC3-Ⅱ、P62、ULK1、Beclin1蛋白表達均升高(P0.05),p-mTOR表達降低(P0.01)。與模型一組相比,模型二組大鼠海馬神經(jīng)元ULK1、P62、Beclin1、P62蛋白表達升高(P0.05),p-mTOR蛋白的表達有降低趨勢(P0.05)。與模型二組相比,穴位埋線組大鼠海馬神經(jīng)元ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表達均降低(P0.05),p-mTOR表達升高P0.05);假埋線組大鼠海馬神經(jīng)元ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62mRNA表達則無明顯差異。結論:1.D-半乳糖致衰模型大鼠和復合衰老模型大鼠在一般狀態(tài)、自主活動能力、學習認知能力、海馬的一般病理組織學結構以及超微結構等方面都出現(xiàn)了衰老變化,自噬的活性下降,而慢性應激可使D-半乳糖致衰模型大鼠的以上行為學、形態(tài)學、分子生物學方面的衰老改變更加嚴重,說明復合衰老模型大鼠的模型建立成功。2.穴位埋線對復合衰老模型大鼠的行為學,包括一般狀態(tài)、反映自主活動能力的曠場實驗、反映學習認知記憶能力的水迷宮實驗都有改善作用。3.穴位埋線可以改善復合衰老模型大鼠海馬神經(jīng)元的一般病理組織學結構以及超微結構。4.穴位埋線通過抑制海馬神經(jīng)元異�？簥^的自噬啟動及自噬小體形成、恢復自噬溶酶體的清除降解功能常,修復完整自噬流,清除海馬神經(jīng)元內(nèi)錯誤折疊蛋白或者受損老化的細胞器,使海馬神經(jīng)元恢復正常的生理活動,延緩海馬的衰老進程�？傊�穴位埋線通過抑制海馬神經(jīng)元異�？簥^的自噬啟動及自噬小體形成、恢復自噬溶酶體的清除降解功能常,修復完整自噬流,使大鼠的海馬一般病理組織形態(tài)及超微結構得以改善,功能得以恢復,從而使大鼠的學習認知記憶能力恢復正常,抗應激損傷,延緩衰老的進程。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R245;R-332

【參考文獻】

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1 宋來新;張長城;王婷;劉珍財;韓貴芳;袁丁;趙海霞;;淫羊藿總黃酮通過抑制MAPK/NF-κB信號通路減輕自然衰老大鼠腦組織炎癥反應[J];中國藥理學通報;2017年01期

2 李小梅;周云龍;高W歐，

本文編號：1381923