發(fā)布時間：2025-06-18 23:51

　　研究背景和目的:骨肉瘤是最為常見的骨組織來源的惡性腫瘤,同時也是兒童惡性腫瘤的主要類型之一。其具有惡性程度高、生長迅速、易發(fā)生侵襲及遷移等特點,患者整體預后差,術后生存率低下。因此,有效的分子靶點對骨肉瘤的治療極其重要。ROCK2在腫瘤的進展中扮演著重要角色,目前認為其可以調節(jié)細胞的收縮與粘附、侵襲及遷移、增殖和凋亡,然而其在骨肉瘤中的表達及影響機制并不清楚。在腫瘤的惡性進展中糖酵解水平顯著提升,PFKFB3作為糖酵解及能量代謝的調節(jié)者,研究證實其在腫瘤的發(fā)展中起著關鍵性作用,然而,PFKFB3在骨肉瘤中的作用及機制研究卻很少。本研究旨在探討骨肉瘤中ROCK2及PFKFB3的表達及相關性,進一步深入探究其影響骨肉瘤生長及轉移的機制。方法:1、免疫組化、熒光定量PCR及免疫印跡法分析ROCK2在骨肉瘤組織中的表達。2、篩選出下調效果最佳的shROCK2質粒并下調骨肉瘤細胞中ROCK2的表達,通過CCK8、EdU實驗觀察細胞生長能力的變化。然后采用流式細胞術檢測細胞周期及凋亡比例變化。接下來通過劃痕愈合和Transwell實驗觀察細胞侵襲及遷移能力的影響。最后我們利用穩(wěn)定轉染shNC/U2-...

【文章頁數】：69 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
中英文縮略詞表
前言
第1章 骨肉瘤組織及細胞中ROCK2 的表達水平
    1.1 引言
    1.2 材料與方法
        1.2.1 材料
        1.2.2 RNA的提取及聚合酶鏈反應(PCR)
        1.2.3 蛋白免疫印跡反應(Western blot)
        1.2.4 HE染色
        1.2.5 免疫組織化學方法
        1.2.6 統(tǒng)計學分析
    1.3 結果
        1.3.1 骨肉瘤組織中ROCK2 的表達情況
        1.3.2 骨肉瘤細胞中ROCK2 的表達情況
    1.4 討論
    1.5 結論
第2章 ROCK2 蛋白對骨肉瘤生長和轉移的影響
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 材料
        2.2.2 細胞培養(yǎng)
        2.2.3 shROCK2 質粒的構建
        2.2.4 qRT-PCR實驗步驟
        2.2.5 Western blot
        2.2.6 CCK8 實驗步驟
        2.2.7 EdU實驗步驟
        2.2.8 流式細胞周期及凋亡
        2.2.9 Transwell實驗
        2.2.10 劃痕實驗
        2.2.11 動物實驗
        2.2.12 統(tǒng)計學分析
    2.3 結果
        2.3.1 ROCK2 最佳干擾質粒的篩選
        2.3.2 CCK8及EdU實驗檢測降低ROCK2 表達后增殖能力影響
        2.3.3 細胞周期實驗檢測降低ROCK2 表達后細胞的周期影響
        2.3.4 流式凋亡實驗檢測降低ROCK2 表達后細胞的凋亡的影響
        2.3.5 Transwell實驗檢測降低ROCK2 表達后侵襲及遷移影響
        2.3.6 劃痕實驗檢測降低ROCK2 基因表達后遷移影響
        2.3.7 體內實驗證實干擾ROCK2 表達細胞增殖能力的影響
        2.3.8 體內實驗證實干擾ROCK2 表達對轉移能力的影響
    2.4 討論
    2.5 結論
第3章 ROCK2 調控骨肉瘤的生長及轉移依賴于PFKFB3 的表達
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 細胞培養(yǎng)
        3.2.3 質粒的構建
        3.2.4 EdU實驗步驟:
        3.2.5 Transwell:
        3.2.6 Western blot實驗步驟
        3.2.7 qRT-PCR實驗步驟
        3.2.8 統(tǒng)計學分析
    3.3 結果
        3.3.1 pcDNA3.1-(+)-ROCK2 質粒的表達
        3.3.2 PFKFB3 在骨肉瘤組織中的表達
        3.3.3 骨肉瘤組織中ROCK2與PFKFB3 表達的相關性
        3.3.4 改變骨肉瘤細胞中ROCK2 表達后,PFKFB3 的表達情況
        3.3.5 PFKFB3是ROCK2 介導的骨肉瘤細胞生長及轉移的關鍵分子
    3.4 討論
    3.5 結論
第4章 ROCK2 抑制PFKFB3 泛素化進而穩(wěn)定其表達
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 材料
        4.2.2 細胞培養(yǎng)
        4.2.3 Western blot實驗方法
        4.2.4 質粒構建
        4.2.5 免疫共沉淀(Co-IP)
    4.3 結果
        4.3.1 PFKFB3 基因在骨肉瘤細胞中通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解
        4.3.2 ROCK2 抑制骨肉瘤細胞PFKFB3 泛素化降解
    4.4 討論
    4.5 結論
全文總結
參考文獻
攻讀學位期間研究成果
致謝
綜述
    參考文獻



本文編號：4050528