發(fā)布時間：2025-06-21 01:13

　　機(jī)體在遭受到有害刺激時,細(xì)胞中會呈現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng),而體內(nèi)的活性氧簇(Reactive Oxygen Species,ROS)就是其中一個重要指標(biāo),當(dāng)自由基水平超標(biāo),機(jī)體自身抗氧化清除能力不足,使得氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡,進(jìn)而造成機(jī)體氧化損傷[1]。因此,實時動態(tài)檢測活細(xì)胞內(nèi)ROS變化顯得尤為重要。目前,檢測活細(xì)胞中ROS水平的方法有外源性和內(nèi)源性兩大方法體系,其中內(nèi)源性探針有細(xì)胞毒性小、生物相容性好等優(yōu)勢,是目前ROS檢測的發(fā)展趨勢。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Epoxy Chloropropane Kelch Sample related Protein-1,Keapl)/核因子 E2 相關(guān)因子 2(Nuclear Factor Erythroid-2 related Factor 2,Nrf2)-抗氧化元件(Antioxidant Response Element,ARE)這樣一條機(jī)體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化信號通路[2]可以改造后作為內(nèi)源性檢測ROS的一條新的途徑。當(dāng)機(jī)體內(nèi)ROS水平處于生理狀態(tài)時,Keapl蛋白質(zhì)介導(dǎo)Nrf2蛋白質(zhì)泛素化降解;當(dāng)機(jī)體受到外界刺激導(dǎo)致ROS水平升高時,N...

【文章頁數(shù)】：153 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
學(xué)位論文數(shù)據(jù)集
摘要
ABSTRACT
符號說明
第一章 緒論
    1.1 活性氧簇(Reactive Oxygen Species, ROS)
    1.2 ROS檢測的重要意義
    1.3 ROS的檢測手段
        1.3.1 roGFP(Reduction-oxidation-sensitive Green Fluorescent Protein)家族
        1.3.2 rxYFP家族
        1.3.3 Redoxfluor (Genetically Encoded Fluorescence Resonance Energy TransferProbe)
        1.3.4 cpYFP
        1.3.5 Hyper系列內(nèi)源性細(xì)胞傳感器
        1.3.6 Redox特異敏感型的量子點探針
        1.3.7 常見的外源性ROS檢測探針
    1.4 基因編碼內(nèi)源性細(xì)胞傳感器的應(yīng)用以及優(yōu)勢
    1.5 293T細(xì)胞中ROS檢測的重要意義
    1.6 ROS是白血病檢測的細(xì)胞水平標(biāo)志物
    1.7 Keap1/Nrf2-ARE信號通路
        1.7.1 Keap1蛋白質(zhì)(Epoxy Chloropropane Kelch Sample related Protein-1, Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1)
        1.7.2 Nrf2(Nuclear Factor Erythroid-2 related Factor 2,核因子E2相關(guān)因子2)
        1.7.3 ARE(Antioxidant Response Element,抗氧化反應(yīng)元件)
        1.7.4 Keap1/Nrf2-ARE信號通路的反應(yīng)機(jī)制
    1.8 課題研究內(nèi)容以及選題意義
        1.8.1 課題主要研究內(nèi)容
        1.8.2 研究成果及創(chuàng)新點
            1.8.2.1 主要研究成果
            1.8.2.2 創(chuàng)新點
第二章 基于Keap1/NRF2-ARE信號通路的內(nèi)源性基因編碼ROS細(xì)胞傳感器的構(gòu)建
    2.1 引言
    2.2 內(nèi)源性基因編碼ROS細(xì)胞傳感器的設(shè)計
    2.3 實驗材料及儀器
        2.3.1 實驗試劑與材料
        2.3.2 實驗儀器與設(shè)備
    2.4 元件序列
    2.5 實驗方法
        2.5.1 pLVX-5XARE-hCMVmp-mCherry-Puro質(zhì)粒構(gòu)建
            2.5.1.1 Oligo退火合成制備5XARE和hCMVmp片段
            2.5.1.2 pLVX-mCherry-T2A-Puro載體骨架制備
            2.5.1.3 目標(biāo)片段與載體骨架連接構(gòu)建重組質(zhì)粒
            2.5.1.4 轉(zhuǎn)化
            2.5.1.5 挑選單克隆菌落并且進(jìn)行PCR驗證以及測序
        2.5.2 pLVX-Keap1-T2A-EGFP-T2A-Nrf2-Puro質(zhì)粒構(gòu)建
            2.5.2.1 Hela細(xì)胞(人源)的總RNA提取
            2.5.2.2 基因組DNA的去除和cDNA的合成
            2.5.2.3 設(shè)計引物并且從cDNA模板上運用PCR手段獲取Keap1和Nrf2基因片段
            2.5.2.4 EGFP片段的獲取
            2.5.2.5 pLVX-T2A-EGFP-Puro質(zhì)粒構(gòu)建
            2.5.2.6 pLVX-Keap1-T2A-EGFP-Puro質(zhì)粒構(gòu)建
            2.5.2.7 pLVX-Keap1-T2A-EGFP-T2A-Nrf2-Puro質(zhì)粒構(gòu)建
        2.5.3 pLVX-5XARE-hCMVmp-mNeonGreen-Puro質(zhì)粒構(gòu)建
            2.5.3.1 含mNeonGreen基因的大腸桿菌復(fù)蘇
            2.5.3.2 mNeonGreen的PCR引物設(shè)計
            2.5.3.3 mNeonGreen基因片段PCR
            2.5.3.4 mNeonGreen基因片段Cycle-Puro
            2.5.3.5 mNeonGreen基因片段和pLVX-5XARE-hCMVmp-mCherry-Puro載體的酶切
            2.5.3.6 膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序和提取去內(nèi)毒素質(zhì)粒
        2.5.4 pLVX-Keap1-T2A- mCherry-T2A-Nrf2-Puro質(zhì)粒構(gòu)建
            2.5.4.1 mCherry基因的PCR引物設(shè)計
            2.5.4.2 mCherry基因片段PCR
            2.5.4.3 mCherry基因片段Cycle-Puro
            2.5.4.4 mCherry基因片段和pLVX-Keap1-T2A-EGFP-T2A-Nrf2-Puro載體的酶切
            2.5.4.5 膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序和提取去內(nèi)毒素質(zhì)粒
        2.5.5 潮霉素(HygR)替代嘌呤霉素(Puro)
            2.5.5.1 HygR基因片段的PCR引物設(shè)計
            2.5.5.2 HygR的片段PCR
            2.5.5.3 HygR基因片段進(jìn)行Cycle-Puro回收
            2.5.5.4 膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序和提取去內(nèi)毒素質(zhì)粒
    2.6 實驗結(jié)果與討論
        2.6.1 基因片段和載體骨架的電泳結(jié)果
        2.6.2 載體檢測電泳結(jié)果
        2.6.3 質(zhì)粒構(gòu)建成功
    2.7 本章小結(jié)
第三章 基于Keap1/Nrf2-ARE信號通路的內(nèi)源性基因編碼ROS細(xì)胞傳感器初步評估
    3.1 引言
    3.2 實驗材料與儀器
        3.2.1 實驗試劑與材料
        3.2.2 實驗儀器與設(shè)備
    3.3 實驗方法
        3.3.1 293T細(xì)胞的培養(yǎng)方法
        3.3.2 H₂O₂外源刺激瞬時轉(zhuǎn)染實驗設(shè)計
        3.3.3 Poly-fector試劑瞬時轉(zhuǎn)染實驗
        3.3.4 lipo3000轉(zhuǎn)染試劑瞬時轉(zhuǎn)染實驗
        3.3.5 H₂O₂外源刺激實驗
        3.3.6 Cytation活細(xì)胞成像實驗
        3.3.7 流式細(xì)胞儀統(tǒng)計實驗
    3.4 實驗結(jié)果與討論
        3.4.1 50 μM H₂O₂處理實驗組以及對照組1實驗現(xiàn)象和推論
        3.4.2 100 μM H₂O₂處理實驗組以及對照組1實驗結(jié)果和推論
        3.4.3 500μM H₂O₂處理實驗組以及對照組1實驗現(xiàn)象和推論
        3.4.4 1 mM H₂O₂處理實驗組以及對照組1
        3.4.5 對照組2實驗現(xiàn)象和推論
        3.4.6 對照組3實驗現(xiàn)象和推論
        3.4.7 對照組4實驗現(xiàn)象和推論
        3.4.8 流式細(xì)胞儀統(tǒng)計結(jié)果
    3.5 本章小結(jié)
第四章 基于Keap1/Nrf2-ARE通路的內(nèi)源性基因編碼ROS細(xì)胞傳感器穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建、篩選和檢測
    4.1 引言
    4.2 實驗材料和儀器
        4.2.1 實驗試劑和材料
        4.2.2 實驗儀器與設(shè)備
    4.3 實驗方法
        4.3.1 鋪293T細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板
        4.3.2 提取慢病毒包裝質(zhì)粒
        4.3.3 病毒包裝
        4.3.4 病毒收集
        4.3.5 病毒濃縮
        4.3.6 病毒侵染
        4.3.7 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇
        4.3.8 H₂O₂評估穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系實驗
        4.3.9 紫杉醇(Paclitaxel,Px)藥物刺激實驗
        4.3.10 白藜蘆醇(Resveratrol,RV)藥物刺激實驗
    4.4 實驗結(jié)果與討論
        4.4.1 病毒包裝檢測
        4.4.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系獲得
            4.4.2.1 內(nèi)源性基因編碼ROS細(xì)胞傳感器①
            4.2.2.2 內(nèi)源性基因編碼ROS細(xì)胞傳感器②
        4.4.3 H₂O₂評估穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系實驗檢測
            4.4.3.1 活細(xì)胞成像實驗
            4.4.3.2 ROS細(xì)胞傳感器①流式細(xì)胞儀實驗
            4.4.3.3 ROS細(xì)胞傳感器②流式細(xì)胞儀實驗
        4.4.4 紫杉醇(Paclitaxel)藥物刺激實驗
            4.4.4.1 紫杉醇實驗濃度確定
            4.4.4.2 細(xì)胞傳感器①紫杉醇藥物刺激實驗
            4.4.4.3 細(xì)胞傳感器②紫杉醇藥物刺激實驗
        4.4.5 白藜蘆醇(Resveratrol,RV)藥物刺激實驗檢測
            4.4.5.1 白藜蘆醇實驗濃度確定
            4.4.5.2 細(xì)胞傳感器①白藜蘆醇藥物刺激實驗
            4.4.5.3 細(xì)胞傳感器②白藜蘆醇藥物刺激實驗
    4.5 本章小結(jié)
第五章 基于Keap1/Nrf2-ARE信號通路的內(nèi)源性ROS細(xì)胞傳感器在白血病細(xì)胞中的應(yīng)用
    5.1 引言
    5.2 實驗材料及儀器
        5.2.1 實驗試劑與材料
        5.2.2 實驗儀器與設(shè)備
    5.3 實驗方法
        5.3.1 HL-60細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染實驗
        5.3.2 HL-60細(xì)胞病毒侵染實驗
        5.3.3 H₂O₂刺激實驗
    5.4 實驗結(jié)果與討論
        5.4.1 500μM H₂O₂外源刺激實驗結(jié)果
        5.4.2 1.0 mM H₂O₂外源刺激實驗結(jié)果
    5.5 本章小結(jié)
第六章 結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
致謝
研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
作者與導(dǎo)師簡介
附件



本文編號：4051686