發(fā)布時間：2025-03-20 05:29

　　 【目的】絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶K(Serine/Threonine protein kinases K)是分枝桿菌類似真核樣的蛋白激酶,預(yù)測在分枝桿菌的生長和新陳代謝等生理過程中起著重要的作用,解析PknK的生物功能及作用機制,將為結(jié)核病的防治提供一定的理論基礎(chǔ)。【方法】通過基因敲除等遺傳方法獲得結(jié)核分枝桿菌疫苗株BCG的pknK敲除菌株△pknK、回補菌株pMV361-pknK/△pknK和過表達(dá)菌株pMV261-pknK/BCG;對獲得的菌株進(jìn)行生長曲線測定和抗藥性分析;通過pulldown-MS方法及生物信息學(xué)方法鑒定了PknK相互作用蛋白�！窘Y(jié)果】監(jiān)測各種分枝桿菌△pknK、pMV361-pknK/△pknK和pMV261-pknK/BCG生長,確定PknK負(fù)調(diào)控BCG生長;抗藥性分析顯示PknK降低BCG的耐藥性;pulldown-MS方法顯示PknK與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PknA和雙組分系統(tǒng)中的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子MtrA、TrcR、MoxR等蛋白相互作用�！窘Y(jié)論】研究發(fā)現(xiàn)PknK調(diào)控分枝桿菌的生長和耐藥性,我們的研究為深入研究PknK在結(jié)核分枝桿菌中的功能奠定了基礎(chǔ)。

【文章頁數(shù)】：12 頁

【部分圖文】：

圖1.敲除菌株的構(gòu)建模型及鑒定圖譜

以BCG基因組為模板，PCR實驗擴(kuò)增目的基因pknK，引物(表1)為pknK-F和pknK-R。使用限制性內(nèi)切酶HpaI和HindIII對擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pMV361進(jìn)行酶切，并連接酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，LB培養(yǎng)基(卡那霉素50mg/L)培養(yǎng)。挑選單菌落進(jìn)行基因測....

圖2.PknK負(fù)調(diào)控BCG的生長

獲得敲除菌株△pknK后，我們首先檢測了PknK對細(xì)菌的生長是否有影響�！鱬knK和BCG接種于7H9培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每12h取樣測定OD600值。在前期48h，△pknK生長比BCG稍微有生長優(yōu)勢；在后期，與野生型BCG比，敲除菌株△pknK有明顯的生長優(yōu)勢；回補菌株pMV3....

圖3.PknK降低BCG的耐藥性

為了進(jìn)一步了解PknK的生物功能，我們利用pulldown-MS的方法篩選與PknK蛋白相互作用的候選蛋白(圖4-A)。為了獲得直接與PknK相互作用的蛋白，我們在大腸桿菌中表達(dá)了PknK蛋白，與Ni-NTABeads孵育，用磷酸鹽緩沖液沖洗獲得Ni-NTAbeads-Pkn....

圖4.Pulldown-MS方法鑒定PknK互作蛋白

圖3.PknK降低BCG的耐藥性在質(zhì)譜分析篩選出的靶標(biāo)蛋白中，我們挑選了PknA與PknK進(jìn)行了體外pulldown實驗驗證。首先，我們構(gòu)建了PknA的表達(dá)質(zhì)粒pGEX-5x-pknA，并轉(zhuǎn)化得到表達(dá)菌株。純化的GST-PknA與PknK-His混合孵育，用GST-tag進(jìn)行p....

本文編號：4037456